达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)冬眠启动过程中枢生长抑素信号对HPA轴的抑制

摘 要：生长抑素作为一种具有广泛抑制性作用的多肽类激素，对多种激素及机体功能均具有抑制作用。为探索冬眠动物冬眠启动过程中枢生长抑素信号系统的变化及其影响，实验选择典型的贮脂类冬眠动物达乌尔黄鼠为研究对象，按照其状态分为快速育肥期、育肥完成期、冬眠期3个时期，分析下丘脑-垂体-肾上腺轴及生长抑素信号在冬眠启动过程中的变化。采用免疫组织化学法检测下丘脑生长抑素神经元平均光密度及垂体促肾上腺皮质激素水平和生长抑素受体2的表达，采用放射性免疫法检测血清皮质醇的浓度及测定肾上腺质量。结果显示：冬眠启动过程中下丘脑生长抑素神经元平均光密度无显著变化，垂体生长抑素受体2的表达量在育肥完成期最高，显著高于冬眠期和快速育肥期;垂体促肾上腺皮质激素和血清皮质醇浓度变化趋势相同，从育肥完成期到冬眠期呈下降趋势，且冬眠期显著降低;育肥完成期肾上腺质量显著下降。提示冬眠启动过程中下丘脑-垂体-肾上腺轴受到抑制，中枢生长抑素信号具有重要调节功能。

关 键 词：达乌尔黄鼠; 冬眠; 生长抑素; 下丘脑; 垂体; 肾上腺

中图分类号：Q95 文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1673-5862.2023.02.015

Inhibition of HPA axis by central somatostatin signaling during hibernation initiation in Spermophilus dauricus

SONG Shiyi， CEN Yuqing， ZHAI Bomei， LI Jing， YANG Ming

（College of Life Sciences， Shenyang normal University， Shenyang 110034， China）

Abstract：Somatostatin is a peptide hormone with a wide range of inhibitory effects， inhibiting a variety of hormones and body functions. In order to explore the changes and effects of somatostatin signaling in hibernation priming， the typical fat storage hibernating animals Spermophilus dauricus were selected as the experimental animals， which were divided into three periods， rapid fattening， finish fattening， hibernation， according to their states. The changes of somatostatin signaling system in hypothalamic-pituitary-adrenal axis during hibernation initiation were analyzed. Mean density of hypothalamic somatostatin neurons， the levels of adrenocorticotropic hormone and expression of somatostatin receptor 2 in pituitary by immunohistochemistry， serum cortisol by radioimmunoassay and adrenal mass were measured in this article. The results show that mean density of hypothalamic somatostatin neurons did not change significantly during hibernation initiation， the expression of pituitary somatostatin receptor 2 was the highest at the finish fattening and significantly higher than that in hibernation and rapid fattening period. pituitary adrenocorticotropic hormone and serum cortisol concentrations followed the same trend， with a decreasing trend from finish fattening to hibernation and a significant decrease in the hibernation period; significant decrease in adrenal mass during finish fattening period. Suggest that the hypothalamic-pituitary-adrenal axis is inhibited during hibernation initiation， the central somatostatin signaling has an importan regulatory function.

Key words：Spermophilus dauricus; hibernation; somatostatin; hypothalamus; pituitary; adrenal

生长抑素（somatostatin，SST）是一种由下丘脑分泌的具有广泛抑制作用的环状肽，又称生长抑制因子，在细胞的生长和凋亡中起着重要的调控作用。SST与膜受体生长抑素受体（somatostatin receptor，SSTR）结合，激活细胞内特定的信号通路从而发挥其抑制作用。垂体中主要表达SSTR 1，2和5亚型，其中SSTR2在啮齿动物神经系统中表达最多^［1-5］。在冬眠启动过程中，激素水平下降，细胞增殖受抑制，应激反应减少^［6］，依据生长抑素特殊的“刹车”作用，生长抑素可能会抑制垂体激素，推测其可能参与了哺乳动物的冬眠启动过程。

本实验以典型的贮脂类冬眠动物达乌尔黄鼠为研究对象，探究下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴的生长抑素途径在冬眠启动过程中的变化，进一步揭示冬眠机理，了解冬眠动物在应对不良环境条件的野外生存策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物2018年5月捕自中国内蒙古额尔古纳市黑山头镇（50.13°N， 119.34°E），为采用笼捕法捕获的雌性成年达乌尔黄鼠，监测动物体重及寄生虫情况，带回沈阳师范大学动物房进行单笼饲养（48cm×35cm×20cm）。笼内铺盖碎刨花并为每只动物编号，将所有动物放置于（23±2）℃的恒温空调房中，等光照饲养，光周期为光照∶黑暗12h∶12h; 水和食物充足，饲喂标准鼠饲料，每周进行一次体重测量。当动物体重连续两周出现下降后移入低温房，低温房温度为（5±2）℃，恒黑饲养，笼内铺盖碎刨花和干燥的棉花作为巢材，水和食物自取。用纸片法记录冬眠时间^［7］。

1.2 动物分组

本研究的实验动物共36只，根据动物的体重变化和季节阶段将其分为3个时期：动物育肥过程中体重增长率达到最大记为快速育肥期（rapid fattening，RF）; 动物体重增长至峰值后持续下降2周记为育肥完成期（finish fattening，FF）;持续冬眠一周记为冬眠期（hibernation，H）。每个时期中8只动物做常规取材，4只做灌流取材。

1.3 体重的测定

为减少称重影响，使用捕鼠笼称量，将动物放入捕鼠笼内，置于精度为0.1g的电子天平上，待动物不再活动后记录数值，所得数值除去捕鼠笼重量即为达乌尔黄鼠体重。

1.4 常规取材及血清制备

将动物用异氟烷麻醉后迅速断颈处死，收集血液于离心管中，放入已预冷（4℃）的离心机离心，4500rpm，30cmin，用移液枪吸取上清液，-80℃冻存，用于血清皮质醇（cortisol，COR）的检测。

将动物置于冰盘上，沿腹中线剪开腹腔，剪下肾上腺，吸水纸吸干多余的组织液，电子天平称重，记录质量。

1.5 灌流取材

动物麻醉方法同上，剪开胸腔皮肤及肋骨，暴露心脏，进行灌流处理，将注射器的针头自左心室插入，止血钳固定，剪开右心耳。先后注入生理盐水（250mL左右）和4%多聚甲醛固定液（250mL左右）。达乌尔黄鼠肝脏等血液丰富的器官由红转白，动物四肢及躯干僵硬，说明灌流成功。脑及垂体取材方法同上，置于含有固定液的离心管中，4℃保存，用于下丘脑SST和垂体SSTR2、促肾上腺皮质激素（adrenocoticotropic hormone，ACTH）表达测定。

1.6 测定指标

1.6.1 血清COR浓度测定

用北京北方生物技术研究所生产的放射性免疫试剂盒测定血清COR。按试剂盒说明书操作。

1.6.2 下丘脑SST、垂体SSTR2和ACTH表达测定

采用免疫组织化学方法测定下丘脑SST、垂体SSTR2和ACTH的表达，用平均光密度代表不同时期相对应的表达。按免疫组织化学试剂盒（江苏康为世纪生物科技有限公司）说明书操作。使用摄像显微镜（日本Olympus公司）在100×，400×下拍摄上、下、左、右、中5个视野，使用Image-Pro Plus软件打开图片，选中所有阳性区域（阳性细胞为棕褐色），设置项目参数，测定平均光密度。

1.7 数据统计分析

使用SPSS 20.0数据分析软件（SPSS Inc.， Chicago， IL， USA）对实验结果进行统计分析。实验所得数据采用单因素方差分析（analysis of variance， ANOVA）分析，然后进行最小显著性差异法（least significant difference，LSD）分析。数据用“平均值±标准误差”表示，Plt;0.05时，代表组间差异显著，具有统计学意义。

2 结 果

2.1 冬眠启动过程中体重变化

达乌尔黄鼠在入眠过程中体重不断变化，RF时期平均体重为（170.0±4.0）g，FF时期平均体重为（213.7±8.5）g，H时期平均体重为（164.0±7.9）g，动物的体重在FF时期显著高于RF时期和H时期（F=14.03，Plt;0.05），RF时期与H时期无显著差异（图1）。

2.2 下丘脑SST和垂体SSTR2平均光密度

达乌尔黄鼠不同时期下丘脑SST免疫组织化学染色结果显示，在冬眠启动过程中下丘脑SST平均光密度无显著差异（Pgt;0.05，表1）。达乌尔黄鼠不同时期垂体SSTR2免疫组织化学染色结果显示，在冬眠启动过程中垂体SSTR2平均光密度表达存在差异（图2）。FF时期垂体中SSTR2表达量显著高于RF时期和H时期（Plt;0.05），RF时期和H时期无显著差异（表1）。

2.3 垂体ACTH含量测定

达乌尔黄鼠不同时期免疫组织化学染色结果显示，垂体ACTH平均光密度在不同时期存在差异（图3）。

FF时期垂体ACTH平均光密度最高，为153.6±3.1，显著高于RF时期和H时期，RF时期平均光密度为130.3.8±1.1，显著低于FF时期但高于H时期，H时期平均光密度最低，为109.0±3.7，组间均差异显著（Plt;0.05，图4）。

2.4 血清COR浓度及肾上腺重量

放射性免疫法检测COR的浓度。达乌尔黄鼠在冬眠启动过程血清中COR浓度出现下降趋势，血清中COR含量在H时期最低，显著低于RF时期和FF时期（Plt;0.05），RF时期与FF时期无显著差异（表2）。肾上腺质量在FF时期显著下降，显著低于RF时期（Plt;0.01），与H时期差异不显著（表2）。

3 讨 论

HPA轴作为重要的反馈调节系统，是神经内分泌网络的枢纽，对维持机体内环境平衡起重要作用^［8］。COR是肾上腺在应激反应里产生的一种糖皮质激素，由肾上腺皮质束状带分泌，参与调节糖代谢过程，促进糖原、脂肪的分解及糖异生。COR的分泌受到HPA轴的调节，应激情况下，促皮质素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）的合成和分泌增加，CRH通过垂体门脉系统到达腺垂体，与腺垂体细胞膜上相应的受体结合，腺垂体ACTH分泌增加，ACTH通过血液循环到达肾上腺，从而引起肾上腺皮质合成和释放糖皮质激素^［8］。

SST由下丘脑分泌^［9-10］，纤维束从室旁核的前部延伸到乳头体的后部，经过垂体门静脉系统作用于垂体前叶细胞，进而调节垂体激素的分泌^［11-13］。SST可以抑制ACTH的释放，成为HPA轴中的重要调控因子，表现为神经系统兴奋性降低、心率下降及应激反应下降等^［14］。聚合酶链式反应分析表明，在厌食小鼠下丘脑中，生长抑素信使核糖核酸的表达显著增加，同时，将生长抑素应用于正常饮食的动物中，其摄食量明显少^［15］。

冬眠是动物适应外界环境的一种生活策略，面对极端环境或食物资源匮乏时部分动物会进入不同程度的蛰眠状态^［16］。在冬眠过程中，动物的代谢率、体温、呼吸频率和心率等各种生理活动受到抑制^［16-17］。冬眠启动中HPA轴有重要影响，肾上腺糖皮质激素具有促进脂解及抗脂肪合成的作用， 因而大部分冬眠动物的肾上腺存在春季活动旺盛， 秋、冬季活动能力较低的季节变化^［18］。已有研究显示，野外和实验室饲养的冬眠动物肾上腺功能存在季节性差异，繁殖期COR水平最高^［19］，冬眠期间COR维持在较低的水平，同时肾上腺质量也呈现季节性差异^［20］。动物的体重在入眠过程中表现出稳定的增加，达到峰值后缓慢下降，并逐渐进入冬眠，体重峰值是初始体重的2倍; 按照不同组的划分，FF时期的体重显著高于RF时期和H时期。

从对达乌尔黄鼠不同时期下丘脑SST的检测结果来看，生长抑素神经元在FF时期、RF时期、H时期下丘脑中均有不同程度的表达，但无显著差异。垂体中SSTR2表达量在FF时期最高，说明此时生长抑素信号系统作用增强。在啮齿动物中枢神经系统中，SST主要通过与垂体前叶细胞G蛋白偶联受体SSTR2结合发挥其功能^［21-23］，抑制ACTH等垂体激素的分泌^［1-4］。FF时期垂体ACTH表达下降，显著低于RF时期，血清COR浓度也存在显著差异。H时期血清中COR浓度最低，与垂体ACTH变化趋势相同。FF时期的SST信号系统作用增强，抑制垂体ACTH的合成与分泌，导致ACTH浓度下降。

动物在RF时期和FF时期COR始终处于高浓度状态，COR可作用于下丘脑饱食中枢，促进高热量食物的摄入并减少能量消耗，在此过程中，动物不断积累脂肪，体重增加，完成育肥过程。H时期垂体ACTH平均光密度最低，ACTH通过循环系统运输至肾上腺，作用于肾上腺皮质上的2型受体，引起肾上腺皮质合成和释放COR减少，血清COR浓度降低，动物进入冬眠。同时RF时期肾上腺质量最高，冬眠启动过程中肾上腺质量逐渐下降，推测肾上腺功能随着达乌尔黄鼠入眠逐渐减弱。COR作为HPA轴的末端产物，一旦分泌下降，即通过与其相应的受体结合，以负反馈调节的方式分别作用于其上游的一些靶组织，包括垂体、下丘脑等区域，阻止SST信号系统作用进一步增强，以使机体恢复到稳态水平^［24］。这一结果说明达乌尔黄鼠冬眠启动过程中，生长抑素信号系统可能在一定程度上抑制了HPA轴的功能，进而调节动物的代谢过程，阻滞急性应激反应，减少非必要能量消耗。

本实验结果提示，在冬眠启动过程中，中枢生长抑素信号系统具有重要调节功能，但其调节功能可能不局限于HPA轴的内分泌途径。SST有广泛的抑制作用，如抑制垂体激素、胰岛素、胰高血糖素等激素的分泌和多种生理功能，其在贮脂类冬眠动物冬眠中的具体作用机制还有待进一步的研究。

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