柚皮素、柚皮苷与牛血清白蛋白相互作用的机理分析

摘 要：采用荧光光谱法对柚皮素（naringenin， NG）、柚皮苷（柚皮素-7-新橙皮苷，naringin， NA）猝灭牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）荧光发射的机理进行了研究，并使用分子对接技术获得了NG， NA同BSA之间的结合模型。优化了水浴时间和溶液pH等实验条件，荧光测试结果显示NG，NA浓度与BSA的荧光发射强度呈负相关，并且NG猝灭BSA的程度强于NA。通过分析不同浓度NG， NA猝灭BSA的荧光发射可知，NG与NA猝灭BSA的机理都是静态猝灭，即与BSA形成1∶1型非共价复合物。同步荧光光谱实验结果表明，NG与NA对BSA的Trp残基的影响强于对Tyr残基的影响。分子对接结果表明，在BSA的Trp213残基附近存在一个疏水性口袋，NG可以进入其中并与BSA形成复合物，而NA则结合在BSA表面，无论NA还是NG都与BSA的多个氨基酸残基存在氢键或疏水作用。

关 键 词：柚皮素; 柚皮苷; 非共价复合物; 荧光光谱法; 同步荧光光谱法; 分子对接

中图分类号：TQ460.1 文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1673-5862.2023.02.003

Mechanistic analysis the binding interactions of naringenin and naringin with bovine serum albumin

YU Zhan^1，2， ZHANG Wei¹， WU Di¹， WU Yuhang¹， LIU Kefan¹， LIU Liyan¹， XIN Shigang³

（1. College of Chemistry and Chemical Engineering， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China; 2. Provincial Key Laboratory for Separation and Analysis of Complex Systems in Liaoning Universities， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China; 3. Experimental Teaching Center， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China）

Abstract：In this work， the quenching mechanism of bovine serum albumin （BSA） by naringenin （NG）， naringin （NA） were investigated by fluorescence spectroscopy and quenching types were acquired. The plausible binding models of NG and NA with BSA were obtained using the technique of molecular docking. The experimental parameters including water bath time and solution pH were optimized， respectively. The fluorescence emission data of BSA showed a trend of reciprocal proportion between quencher concentration and fluorescence emission intensity of BSA. Comparably， the quenching of NG to BSA was more tense than that of NA. Experimental results of synchronous fluorescence spectroscopy experiments indicated that NG or NA affect the Trp residues of BSA more than the Tyr residues. The molecular docking results show that there exists a hydrophobic cavity near the Trp213 residue on the surface of BSA. NG can be embedded into the cavity whereas NA is bonded to the surface of BSA. It is found that there exist multiple hydrogen bonds and hydrophobic interactions between NA or NG and BSA.

Key words：naringenin; naringin; non-covalent complex; fluorescence spectroscopy; synchronous fluorescence method; molecular docking

柚皮素（naringenin，NG）是一种黄烷酮类化合物，NG及其糖苷广泛存在于多种植物的果皮和果肉中^［1］。柚皮苷（柚皮素-7-新橙皮苷，naringin，NA）是最重要的一种NG糖苷^［2］。据报道，NG与NA具有多种药理活性，并且毒性较小^［3-4］，但是它们水溶性差，通过口服被人体吸收具有一定困难，因而对这2种化合物在水溶液条件下与蛋白质尤其是载体蛋白间相互作用的报道不多。由于NG与NA具有良好的药物潜质，研究NG， NA在模拟生理条件下与载体蛋白间的相互作用是十分必要的，这将为NG与NA的药学应用提供基础数据。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是一种分子量为66 kDa、具有α-螺旋结构和17个二硫键的非糖基化球蛋白，也是激素、脂肪酸等小分子化合物的载体蛋白，是牛血液的主要成分。由于与人血清白蛋白（human serum albumin， HSA）具有高度的结构相似性，BSA作为模式蛋白在多个领域受到了广泛研究^［5］。本文通过荧光光谱法研究了NG， NA对BSA荧光发射的猝灭作用，得到NG， NA在BSA上的结合常数、位点等信息，并通过分子对接法获得了BSA-NG与BSA-NA复合物可能的结构，为NG， NA的药物应用及功能食品研究提供基础数据^［6］。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

NG， NA（对照品，上海如吉公司）; BSA（纯度≥98%）、三（羟甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris）（美国Amresco公司）; 其余试剂均为分析纯或更高; 实验用水为超纯水（18.2MΩ·cm）。

荧光光谱仪（Cary Eclipse，美国Varian公司）;高精度恒温水浴器（自制）。

1.2 实验方法

首先配制浓度为0.1mol·L^-1， pH分别为5.4， 6.4和7.4的3份Tris缓冲溶液（含0.1mol·L^-1的NaCl）。随后使用Tris缓冲溶液为溶剂，分别配制不同pH的BSA浓度为5.0×10^-4mol·L^-1的储液。使用最少量无水乙醇分别溶解NG与NA，随后用水分别稀释至1.0×10^-3mol·L^-1备用。

样品溶液配制方法如下：在若干支一次性聚丙烯离心管中准确移入1.0mL的Tris缓冲溶液和20μL BSA储液，然后准确移取一定体积（0～30μL）的NG（或NA）储液，定容至4.0mL，其中NG（或NA）浓度分别为0， 1.25×10^-6， 2.50×10^-6， 3.75×10^-6， 5.00×10^-6， 6.25×10^-6及7.50×10^-6mol·L^-1。样品溶液经过一定时间（10～120min）恒温水浴后进行荧光测试。荧光光谱仪参数如下：激发波长（λ_ex）为280nm，荧光发射扫描在285～450nm;同步荧光光谱法波长差分别为Δλ=15和60nm。

用于分子对接的BSA的三维结构信息来自PDB（protein date bank）数据库，PDB ID为4F5S。NG和NA的三维结构数据来自PubChem，使用前均经过MMFF94分子力场优化^［7］。本文使用Autodock 4.2^［8］进行分子对接，Grid设为边长是12.6nm的立方体，Grid间隔为3.75×10^-2nm。采用拉马克遗传算法（Lamarckian genetic algorithm，LGA）优化对接结果，参数为ga_pop_size=150， ga_num_evals=2.5×10⁷， ga_run=100。使用LigPlot+程序^［9］分析对接结果。

2 结果与讨论

2.1 水浴时间对荧光猝灭的影响

配制5组pH为7.4、浓度为2.5×10^-6mol·L^-1的BSA样品溶液，其中NG浓度分别为0， 1.25×10^-6， 2.50×10^-6， 3.75×10^-6， 5.00×10^-6， 6.25×10^-6和7.50×10^-6mol·L^-1。将这些样品溶液置于310K水浴中，时间分别为10， 30， 60， 90和120min，随后立即进行荧光分析。当λ_ex=280nm时，BSA的λ_{em， max}=347nm。据此波长下体系荧光发射数据，计算其F₀/F（无猝灭剂时荧光剂BSA发光强度与加入猝灭剂NG后荧光剂发光强度之比），分别为1.12， 1.13， 1.15， 1.18和1.17。随着水浴时间的增加，NG对BSA的猝灭程度越来越强。水浴90min时NG对BSA的猝灭达到最大。总体来看，水浴时间对NG猝灭BSA的影响较小，并且蛋白质溶液长时间置于空气中会增加氧化的概率，因而本文选取30min作为水浴时间。

2.2 溶液pH对荧光猝灭的影响

按照2.1中主客体浓度与溶液组成，分别配制pH为5.4， 6.4及7.4的含NG（或NA）的BSA溶液，在310K下水浴30min后立刻进行荧光分析，F₀/F与［Q］的关系示于图1，其中［Q］为猝灭剂浓度。由图1可见，不同pH时F₀/F对［Q］均呈现良好线性关系，但是pH可以影响NG对BSA的猝灭程度，其中pH为7.4时NG的猝灭效果最好。可能的原因是BSA在生理pH时结构舒展、开放，利于猝灭剂接近并产生相互作用。NA所得结果与NG相同。

2.3 NG， NA对BSA的猝灭作用

在水浴温度为310K、水浴时间为30min及pH为7.4的条件下进行NG及NA猝灭BSA实验，获得如图2所示的荧光光谱图。随着NG及NA的增加，BSA发生明显的荧光猝灭，且NG猝灭能力强于NA。

2.4 NG， NA猝灭BSA荧光机理分析

使用Stern-Volmer公式讨论NG， NA猝灭BSA的机理：

其中：τ₀是平均荧光寿命（s），生物大分子一般为10^-8s^［10］;k_q是为双分子碰撞猝灭常数;K_SV是猝灭常数。

将图2中347nm处对应数据代入式（1）拟合计算，得到如图3所示的结果，计算可得NG的K_SV（NG）为8.2×10¹²L·（mol·s）^-1，NA的K_SV（NA）为2.6×10¹²L·（mol·s）^-1。由于这2个值都远大于大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数2.0×10¹⁰L·（mol·s）^-1［11］，所以可以确定NG，NA对BSA的猝灭机理都是静态猝灭^［12］，即发光物与猝灭剂通过形成复合物实现猝灭。

当发生静态猝灭时，可通过双对数曲线方程进行分析：

其中：K_A为复合物的结合常数;n为结合位点数。

将图2中BSA最大发射波长处强度数据代入式（2）拟合计算，得到如图4所示的结果。对于NG，计算得其n为1.03，K_A（NG）为1.31×10⁵L·mol^-1;对于NA，计算得其n为1.13，K_A（NA）为1.08×10⁵L·mol^-1。由此可见，NG， NA都可以与BSA形成1∶1的复合物，并且NG的结合能力更强。

2.5 同步荧光分析

BSA之所以具有内源性荧光是由于其含有的芳香族氨基酸，而280nm波长激发BSA产生的荧光发射主要来自于Trp与Tyr残基的贡献，其中Trp残基的贡献大约是Tyr残基的10倍以上^［13］。波长差15nm和60nm同步荧光法可用来研究上述2种残基对蛋白质发光的贡献。依照2.3中方法配制系列样品溶液，进行同步荧光测试，结果如图5所示。

可以看出，无论何种条件下，猝灭剂的增加都会导致体系荧光发射下降，且伴有轻微红移，说明这些芳香族残基所处的微环境极性增大，疏水性减少，表明NG和NA都可以导致BSA空间构象发生一定程度的改变。通过对比图像可以看出NG和NA的加入对Trp残基荧光发射的猝灭能力要高于Tyr残基，因而推测NG或NA与BSA形成复合物后，对Trp残基的影响要大于Tyr残基。

2.6 分子对接结果分析

分子对接可用于研究大分子对小分子的识别，并揭示可能的复合物结构。图6（a）为得分最高的BSA-NG对接结果的三维构象图。BSA表面具有一个疏水口袋，并且由于NG分子形状和极性匹配，可以进入此空腔。图6（b）为得分最高的BSA-NA对接结果的三维构象图，由图6（b）可见，BSA-NA复合物同BSA-NG复合物在结构上存在较大不同，NA结合在BSA表面而不是空腔中。推测其原因之一可能是NA分子具有体积较大的新橙皮苷，因而无法进入BSA表面的疏水性空腔中，只能结合在表面;原因之二可能是NA的新橙皮苷部分羟基较多极性较强，因而与BSA表面多个极性残基之间存在较强的氢键作用，这种作用阻止了NA进入BSA的空腔中。

本文进一步采用LigPlot+软件分析了BSA-NG与BSA-NA复合物中主客体间的相互作用关系，结果示于图7。在图7（a）中，BSA的多个氨基酸残基，如Val481， Gly327， Lys350， Leu480及Trp213等形成一个疏水性口袋，NG就结合在其中，并且与Trp213， Lys350及Asp323间存在多个氢键作用，与Val481，Leu346，Ala212等残基间存在疏水作用。当弱极性的NG进入空腔后，与BSA存在疏水、氢键等多重作用，最终影响Trp213残基所处环境，由此猝灭BSA的荧光发射。

从图7（b）可以看出，NA与BSA的Arg144，His145，Ser428等多个极性氨基酸残基之间存在氢键作用，还与Arg458，Leu189，Ser192等氨基酸残基之间存在疏水作用。但由于NA结合位置距离BSA中仅有的2个Trp基团（Trp134与Trp213）较远，因而对Trp残基的影响有限，猝灭能力弱于NG，与荧光实验结果相符。

3 结 论

本文通过实验结合理论的方法系统研究了NG，NA对BSA的猝灭。结果表明，NG，NA对BSA的猝灭作用符合静态猝灭机制，其中，NG与BSA的结合常数为1.31×10⁵L·mol^-1，NA与BSA的结合常数为1.08×10⁵L·mol^-1。同步荧光法与分子对接结果揭示了NG与NA在BSA上的结合位置，NG结合在BSA的Trp213残基附近的疏水口袋中，而NA结合在BSA分子的表面上，氢键与疏水作用是复合物形成的主要因素。

参考文献：

［1］PATEL K，SINGH G K，PATEL D K. A review on pharmacological and analytical aspects of naringenin［J］. Chin J Integr Med， 2018，24（7）：551-560.

［2］CHEN R，QI Q L，WANG M T，et al. Therapeutic potential of naringin： An overview［J］. Pharm Biol， 2016，54（12）：3203-3210.

［3］ALAM M A，SUBHAN N，RAHMAN M M，et al. Effect of citrus flavonoids， naringin and naringenin on metabolic syndrome and their mechanisms of action［J］. Adv Nutr， 2014，5（4）：404-417.

［4］MEMARIANI Z，ABBAS S Q，UL HASSAN S S，et al. Naringin and naringenin as anticancer agents and adjuvants in cancer combination therapy： Efficacy and molecular mechanisms of action， a comprehensive narrative review［J］. Pharmacol Res， 2021，171：105264.

［5］JAHANBAN-ESFAHLAN A，OSTADRAHIMI A，JAHANBAN-ESFAHLAN R，et al. Recent developments in the detection of bovine serumalbumin［J］. Int J Biol Macromol， 2019，138：602-617.

［6］LI X，LIU H，WU X，et al. Exploring the interactions of naringenin and naringin with trypsin and pepsin： Experimental and computational modeling approaches［J］. Spectrochim Acta A Mol Biomol， 2021，258：119859.

［7］HANWELL M D，CURTIS D E，LONIE D C，et al. Avogadro： An advanced semantic chemical editor， visualization， and analysis platform［J］. J Cheminformatics， 2012，4（1）：17.

［8］MORRIS G M，HUEY R，LINDSTROM W，et al. AutoDock4 and AutoDockTools4： Automated docking with selective receptor flexibility［J］. J Comput Chem， 2009，30（16）：2785-2791.

［9］LASKOWSKI R A，SWINDELLS M B. LigPlot+： Multiple ligand-protein interaction diagrams for drug discovery［J］. J Chem Inf Model， 2011，51（10）：2778-2786.

［10］LAKOWICZ J R，WEBER G. Quenching of fluorescence by oxygen probe for structural fluctuations in macromolecules［J］. Biochemistry， 1973，12（21）：4161-4170.

［11］JAYABHARATHI J，JAYAMOORTHY K，THANIKACHALAM V，et al. Fluorescence quenching of bovine serum albumin by NNMB［J］. Spectrochim Acta A Mol Biomol， 2013，108：146-150.

［12］张冰卫，李博，夏文水，等. 用荧光光谱法研究分子间结合常数和结合位点数时的公式选择［J］. 药学进展， 2011，35（7）：296-303.

［13］SHI J H，LOU Y Y，ZHOU K L，et al. Elucidation of intermolecular interaction of bovine serum albumin with Fenhexamid： A biophysical prospect［J］. J Photochem Photobiol B Biol， 2018，180：125-133.