甘蔗遗传转化与基因编辑技术研究进展

黄堂伟 许誉芝 黄振

摘 要：甘蔗遗传背景复杂，采用常规育种方法进行甘蔗品种选育耗时较长，对亲本的要求也较高，杂交后代分离严重，且会携带一些不需要的基因。利用基因工程可定向导入特定性状的基因，从而培育具有高产量和高价值的作物。文章在系统描述各种遗传转化和转基因技术的基础上，分析农杆菌介导的遗传转化法、基因枪介导的遗传转化法、电穿孔转化法和聚乙二醇（PEG）介导法，发现主要的使用方法为农杆菌转化法和基因枪转化法，电穿孔转化法和PEG介导法存在干扰因素较多，其主要问题是转化效率低、转基因株系鉴定结果不明确，还需进一步完善。基因编辑技术主要是RNAi沉默法和CRISPR编辑法，但甘蔗基因组研究还未取得突破性进展，因此基因编辑仍以基因沉默法为主要手段，可供甘蔗育种中进行遗传转化和转基因技术应用时借鉴。

关键词：甘蔗；基因工程；CRISPR技术；分子标记；转基因

中图分类号：S566.1                             文献标志码：A 文章编号：2095-820X（2023）06-0027-07

收稿日期：2023-10-28

基金项目：广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（2023KY1233）；广西农业职业技术大学校级科研项目（XKJ2316）

通讯作者：黄振（1994-），男，讲师，主要从事甘蔗育种研究工作，E-mail：huangzhenhn@163.com

第一作者：黄堂伟（1988-），男，讲师，主要从事作物栽培及育种研究工作，E-mail：huangtw@gxnzd.edu.cn

0 引言

甘蔗是全球第一大糖料作物，也是重要的能源作物，世界糖产量的75%来源于甘蔗，而我国85%以上的糖产量来源于甘蔗［1］，因此，保证糖料供应是保障国家蔗糖安全的重要举措。甘蔗作为异源多倍体作物，遗传背景复杂，生长周期较长，进行传统育种困难较多，很难同时改变多种不良性状［2］。目前我国登记的甘蔗品种较多，但商业化种植品种依然较单一，只有新台糖（ROC）、桂糖和桂柳系列等［3］。甘蔗育种主要目标为高糖、高产、抗病、抗虫、抗旱、宿根性长和适宜机械收割等，但通过常规育种很难达到目的。转基因技术具有缩短育种时间、按需导入目的基因和避免常规育种出现大量基因重组所导致的复杂筛选过程等优势［4］。通过转基因育种技术，在重要粮食作物、经济作物及园艺作物增产、抗逆和改善品质等方面已取得重大突破，培育了性状优异的小麦［5，6］、玉米［7］和水稻［8］等作物新品种。由于甘蔗直接用于榨糖或制备能源燃料，没有人类直接食用过程，所以转基因甘蔗株系不会对人体造成负面影响。因此，在国际上转基因甘蔗被认为是风险最低（I级）的转基因作物，科研工作者已在不断探索基因工程在甘蔗上的应用前景，发现其具有巨大应用潜力［9］。文章对植物的遗传转化方法和转基因技术进行系统综述，并讨论目前适合于甘蔗转基因育种的方案。在此基础上阐述甘蔗通过转基因技术育种存在的困难，分析甘蔗转基因技术培育新品种的解决方案，针对存在的转化效率低、转基因株系鉴定结果不明确和愈伤组织培育易水渍化和褐化等问题，探讨解决方法，旨在为甘蔗遗传转化和转基因技术应用提供借鉴。

1 转基因技术

1.1 农杆菌转化法

农杆菌是一种土栖革兰氏阴性细菌，具有将Ti质粒的一部分移動并整合到被感染植物细胞核中的天然能力［10］。利用农杆菌的这种能力，Fraley等［11］已通过其开发的缺乏肿瘤形成基因的改良农杆菌菌株，将目的基因转移到植物中。利用该农杆菌进行遗传转化具有转化效率较高、转运的DNA片段经常作为单一拷贝集成并稳定遗传给后代及设备成本低等优点［12，13］。此外，较少的基因整合至受体植物基因组可防止目标基因被沉默［14］。

根癌农杆菌介导的遗传转化是双子叶植物中常规的基因转移方法。禾本科单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，所以禾本科作物一直被认为是难以应用农杆菌介导转化的物种。这是因为单子叶植物特别是草类，很少或不分泌酚类化合物［15］，且在细胞上缺乏依赖于根癌农杆菌的受体位点，降低了T-DNA启动子在单子叶植物中的活性［16］。但农杆菌转化单子叶植物已取得突破性进展，通过使用分生组织转化［17，18］、添加信号分子、使用单子叶植物启动子［19］和超强农杆菌菌株等，根癌农杆菌介导的单子叶植物转化体系已经成熟［20］。禾本科植物水稻的农杆菌侵染转化法已较成熟，与甘蔗遗传转化相关的研究也快速进展［21］。Arencibia等［21］在1998年建立了基础性的农杆菌介导甘蔗遗传转化体系，为此后的研究提供了借鉴。Enríquez-Obregón等［22］采用农杆菌侵染甘蔗愈伤组织，获得了抗除草剂的转基因甘蔗植株。滕峥等［23］利用农杆菌介导法，将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织，建立了高效、快速的甘蔗遗传转化体系，为抗寒性甘蔗品种培育奠定了基础。Matusuoka等［24］利用甘蔗品种的愈伤组织和细胞悬浮培养物进行遗传转化，其双元载体pMLH7133-GUS含有新霉素磷酸转移酶nptII基因、潮霉素磷酸转移酶hpt基因和uidA基因，根癌农杆菌菌株为EHA101和LBA4404。李晓梅等［25］以川蔗23号甘蔗品种诱导的胚性愈伤组织为受体材料，首次利用较低浓度农杆菌侵染液（OD600≈0.1）和较短的侵染时间（1.5 min）成功实现了Bt（cry1Ab）基因在甘蔗上转化。NPTII蛋白在胃肠道很容易降解，对人体不产生有害影响，1994年美国环境保护局确认其为安全蛋白，可用于商业用途［26］。通过农杆菌转化系统和基因枪转化系统可将NPTII基因为筛选标记基因的载体成功转化至甘蔗品种Q117，为甘蔗转基因方案提供借鉴［27，28］。

目前，农杆菌转化法用于甘蔗遗传转化还存在愈伤组织分化效率较低导致转化率较低、培养阶段农杆菌在愈伤组织中很难被清除干净导致污染严重、愈伤组织培养易发生水渍化和褐化及转基因株系未能利用Southern blot技术鉴定等不足［29］。

1.2 基因枪法

20世纪80年代发展起来的基因枪介导的遗传转化技术，为植物基因工程提供了一种更简便的方法［30］。利用基因枪转化技术进行植物基因转化较简便，无明显的宿主限制，几乎适用于任何受体材料，且仅需进行简单的组织培养，无需经过复杂的原生质体制备和培养阶段。基因枪转化技术对改善单子叶植物中具有较长生长时间物种的性状更有效［31］。Bower和Birch［29］通过利用包被DNA的微粒高速轰击胚胎愈伤组织，首次获得转基因甘蔗植株，还发现对愈伤组织的轰击速度较对悬浮细胞更高。在单子叶植物启动子Emu的作用下将NPTⅡ基因转化到甘蔗中，通过ELISA和Southern blot可验证转化株系，如在1993年用基因枪将GUS基因导入甘蔗愈伤组织，并检测到GUS基因的表达［32］；随后，Franks和Birch［31］、Arvinth等［32］、Christy等［33］、Rathus和Birch［34］研究发现，GUS和GFP基因可作为报道基因广泛用于检测转基因甘蔗。随着对基因枪法的研究越来越深入，越来越多的转基因甘蔗相继出现。张树珍和郑学勤［35］通过基因枪法分别用植物表达载体pBT和pUBT转化甘蔗，再生植株的Southern杂交结果表明海藻糖合酶基因已整合到甘蔗基因组中。

在抗虫方面，已报道的抗虫基因有Cry1Ab基因、抑肽酶基因和Cry1Aa3基因［32，33，36］。Christy等［33］通过基因枪介导的转化法将马铃薯蛋白酶抑制剂II和雪莲凝集素基因转入甘蔗，可得到抗螟虫甘蔗。Arvinth等［37］应用共转效率较高的3种载体，用基因枪将Cry1Ab基因轰入2个巴西甘蔗栽培品种，也获得抗螟虫的转基因品种，随后通过抗性筛选、PCR检测分析、生物测定和ELISA测试，证实基因已经整合到甘蔗品种中。

应用基因枪法进行高效率遗传转化也存在不足，如需解决选择哪个植物组织培养阶段更合适问题，嵌合体多、外源基因插入拷贝数较多及所获得转基因株系遗传稳定性较差问题，微弹对甘蔗原生质体伤害较大问题。因此，还需对基因枪的参数进行优化［34］。

1.3 电穿孔法

与应用基因枪法成本高和效率低及农杆菌转化法对受体基因型依赖性强和新植株体易褐化相比，电穿孔法已广泛应用于将外源大分子DNA（目的基因）转入受体细胞中，具有操作简单、快速和成本低等特点，常以原生质体为受体，所有细胞在转化后处于相同生理状态，方便观察和比较［38］。Negrutiu等［39］研究表明，以电穿孔法对甘蔗的原生质体进行转化可获得再生甘蔗，为进一步完善制备甘蔗原生质体技术提供依据。Arencibia等［21］于1995年用电激法将携带CaMV35p-Gus-Nos基因的pBI121质粒导入商业品种POJ2878和J60-5的胚性愈伤组织，电激后6～8周，经GUS组织染色法和进行Southern杂交证实得到转基因甘蔗。乐花花等［40］、薛飞等［41］研究指出，利用电穿孔法进行植物原生质体转化，增加载体DNA浓度可提高基因转移效率，但转移效率受电场强度、脉冲持续时间、施加脉冲数量及电穿孔介质组成的影响。因此，进一步开展电穿孔技术研究对于甘蔗遗传转化可产生更大的促进作用。

1.4 聚乙二醇（PEG）介导法

PEG是植物遗传转化最常用的化学诱导剂。Chen等［42］利用PEG为转化剂，将构建好的质粒转化至甘蔗愈伤组织，并通过探针杂交获得转基因株系。虽然PEG介导法仍存在一些局限性，但优点在于原生质体可在不同植物种类中分离和大量转化。此外，基于氯化镁和PEG协同作用的电穿孔转化原生质体记录非常有效。

2 基因编辑新技术

2.1 CRISPR/Cas9系统的发现与机理

CRISPR/Cas系统发现于细菌和古生菌，最初是一段由长度为29 bp的重复片段和32～33 bp的非重复片段间隔相连的重复序列［43］，能为其自身提供一种获得性免疫保护机制，把入侵的DNA整合到自身的DNA片段上，形成前体crRNA，并在tracrRNA协同帮助下最终形成成熟的crRNA；成熟的crRNA引导Cas蛋白复合物对入侵者进行定点切割从而抵御质粒DNA和外源病毒入侵。CRISPR/Cas9系统由Ⅱ型CRISPR系统改造而来，由Cas9蛋白和sgRNA组成，在sgRNA的引导下通过识别保守的间隔相邻基序，Cas9蛋白可对目标DNA进行特异性剪切。目标DNA断裂后，CRISPR/Cas9系统启动修复机制，其中，细胞的非同源末端连接修复（NHEJ）机制重新连接断裂处的基因组DNA，并引入插入或缺失突变；同源重组修复（HDR）机制需有其模板参与，在断裂处插入或替换基因片段［44］。但CRISRP/Cas9系统也存在脱靶问题，对该技术的优化还需进一步探究。

2.2 CRISRP/Cas9系统在植物基因编辑中的应用

邢慧丽［45］通过优化条件建立了一套可高效应用于单子叶和双子叶植物的CRISPR/Cas9基因组编辑方法，为植物基因功能研究提供了有用工具。Shan等［46］通过优化的化脓链球菌Cas9（SpCas9），在两端附着核定位信号（NLS）并表达sgRNA转录物，设计了2个靶向水稻八氢番茄红素脱氢酶基因OsPDS的不同DNA链sgRNA，SP1和SP2破坏水稻原生质体中的内源基因，从原生质体培养18 h开始，检测到有效（15%）的定向诱变，通过PCR/限制性内切酶（PCR/RE）分析以检测2个靶区域的突变，实现在水稻和小麦中进行定点修饰。Shan等［46］、Walt［47］利用根癌土壤杆菌介导的瞬时表达测定法（农杆菌浸润法）在模式植物烟草中共表达具有真核细胞核定位信号和sgRNA的Cas9變体，指出在拟南芥和烟草中应用CRISPR/Cas9系统可进行基因修饰；Miao等［43］通过密码子优化Cas9蛋白，在水稻中获得含有分蘖夹角控制基因LAZY1和叶绿素合成基因CAO1的突变植株。

2.3 CRISPR/Cas9在作物育種上的应用

王延鹏等［48］利用基因组编辑技术，首次在六倍体小麦中获得对白粉病具有广谱抗性的TaMLO基因3个拷贝同时突变的材料；Zhou等［49］利用CRISPR/Cas9系统敲除水稻温敏型雄性不育TGMS基因，得到11个新的雄性不育品系，加快了不育系的培育过程，而且有利于杂种优势利用；Shi等［50］在玉米中利用CRISPR/Cas9系统改造乙烯反应负调控因子ARGOS8基因的启动子区域，获得了新的抗旱玉米品种。美国农业部2016年4月的批文显示，美国政府许可CRISPR基因组编辑的生物可直接用于种植和销售，无需额外对CRISPR改造的农作物进行监管，为基因编辑技术用于农产品的商业生产带来了光明前景［47］。CRISPR/Cas系统目前属于新型定点编辑技术，对甘蔗转基因育种进程的推动具有重要意义。

3 分子标记辅助育种

分子标记技术从20世纪70年代开始在植物形态学上应用，利用分子标记辅助选择引起了植物育种家的重视，并已用于建立小麦、玉米和水稻等基因图谱［51］，构建了18张关于甘蔗分子遗传连锁图谱，使用标记数为1500～2000个［52］，使用的分子标记包括AFLP基因［53］、RFLP基因［54］、TRAP基因［55］、EST-SSR基因［55］和DART基因［56］等，但要想得到覆盖整个甘蔗基因组的遗传图谱，需更多的单核苷酸多态性（SNP）标记。此外，通过QTL定位对甘蔗相关性状进行研究，已获得部分与抗病、抗逆、产量、糖分及农艺性状相关的数量性状座位（QTL）位点［57］。

4 结语

随着育种技术和栽培方法的不断完善，甘蔗的产量和蔗糖含量已得到大幅度提升。通过传统育种、选种和利用基因编辑技术，已获得高糖（F2KP）、抗病（SrMV-P1）、抗虫（Cry1Ac）及抗旱、抗寒和易脱叶甘蔗优良品种［4］。目前，在甘蔗转基因品种利用方面，CTB141175/01-A（CTC 20 BT）是由巴西甘蔗育种技术公司（Centro de Tecnologia Canavieira，CTC）研发、已通过巴西批准的商业化转基因抗虫甘蔗品种，也是世界上第一个获得商业化生产许可的转基因甘蔗品种；2013年由Persero公司（印度尼西亚）研发的转基因抗旱甘蔗NXI-1T、NXI-4T和NXI-6T仅获得印度尼西亚食用和环境安全证书而未实现商业化；Zhao等［58］通过转基因技术构建了抗蚜虫甘蔗株系；广西大学甘蔗研究课题组通过基因枪介导的遗传转化技术，已初步获得转基因甘蔗株系，但基因枪介导法还需进一步优化以提高转化效率［59］。由此可见，基因工程是快速实现作物性状定向改变的有力工具，在提高作物遗传潜力方面具有很大前景。根癌农杆菌虽然是最常用的基因传递系统，可使目的基因稳定转化进入受体基因组，但试验方案还需进一步优化。目前，农杆菌转化法、基因枪介导的转化法、电穿孔法、PEG介导法等转基因方法已应用于转化目的基因，新型基因定点编辑技术和分子标记技术已应用于甘蔗性状选育，以及有分子生物学、生物信息学、遗传学和新一代测序技术等作为甘蔗品种选育的支撑，相信异源多倍体甘蔗在基因组编辑及突破性新品种选育方面会取得新的突破。

参考文献

［1］ 文明富，杨俊贤，潘方胤，等. 甘蔗遗传改良研究进展［J］. 广东农业科学，2016，43（6）：58-63.

［2］ 许莉萍，陈如凯. 甘蔗遗传转化的研究进展［J］. 福建农业大学学报，1998，27（2）：138-143.

［3］ 李奇伟，邓海华. 当前我国甘蔗品种选育与推广中存在的突出问题及对策［J］. 甘蔗糖业，2011（4）：70-76.

［4］ 许莉萍，潘大仁，陈如凯. 基因工程甘蔗：潜能、现状和前景［J］. 生物工程学报，2001，17（4）：371-374.

［5］ Wang N，Tang C L，Fan X，et al. Inactivation of a wheat protein kinase gene confers broad-spectrum resistance to rust fungi［J］. Cell，2022，185（16）：2961-2974.

［6］ Cui M H，Li Y P，Li J H，et al. Ca2+-dependent TaCCD1 cooperates with TaSAUR215 to enhance plasma membrane H+-ATPase activity and alkali stress tolerance by inhibiting PP2C-mediated dephosphorylation of TaHA2 in wheat［J］. Molecular Plant，2023，16（3）：571-587.

［7］ Liu C，He S F，Chen J B，et al. A dual-subcellular localized β-glucosidase confers pathogen and insect resistance without a yield penalty in maize［J］. Plant Biotechnology Journal，2023：14242.

［8］ Yang C，Yu Y，Huang J，et al. Binding of the Magnaporthe oryzae chitinase MoChia1 by a rice tetratricopeptide repeat protein allows free chitin to trigger immune responses［J］. The Plant Cell，2019，31（1）：172-188.

［9］ 冯璐，吴转娣，张跃彬，等. 甘蔗转基因的研究进展［J］. 中国农学通报，2016，32（33）：130-137.

［10］ Gelvin S B. Integration of Agrobacterium T-DNA into the plant genome［J］. Annual Review of Genetics，2017，51（1）：195-217.

［11］ Fraley R T，Rogers S G，Horsch R B，et al. The SEV System：A new disarmed Ti plasmid vector system for plant transformation［J］. Bio/Technology，1985，3（7）：629-635.

［12］ Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al. Efficient transformation of rice （Oryza sativa L.） mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA［J］. The Plant Journal，1994，6（2）：271-282.

［13］ Ishida Y，Saito H，Ohta S，et al. High efficiency transformation of maize（Zea mays L.） mediated by Agrobacterium tumefaciens［J］. Nature Biotechnology，1996， 14（6）：745-750.

［14］ Dai S，Zheng P，Marmey P，et al. Comparative analysis of transgenic rice plants obtained by Agrobacterium mediated transformation and particle bombardment［J］. Molecular Breeding，2001，7（1）：25-33.

［15］ Usami S，Morikawa S，Takebe I，et al. Absence in monocotyledonous plants of the diffusible plant factors inducing T-DNA circularization and vir gene expression in Agrobacterium［J］. Molecular and General Genetics MGG，1987，209（2）：221-226.

［16］ Graves A C F，Goldman S L. The transformation of Zea mays seedlings with Agrobacterium tumefaciens［J］. Plant Molecular Biology，1986，7（1）：43-50.

［17］ Gould J，Devey M，Hasegawa O，et al. Transformation of Zea mays L. using Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex 1［J］. Plant Physiology，1991，95（2）：426-434.

［18］ Smith R H，Hood E E. Agrobacterium tumefaciens transformation of monocotyledons［J］. Crop Science，1995，35（2）：11183.

［19］ Hood E E，Gelvin S B，Melchers L S，et al. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants［J］. Transgenic Research，1993，2（4）：208-218.

［20］ 李松，陈丽新，谭芳，等. 农杆菌介导及基因枪转化在我国甘蔗遗传转化的应用研究现状［J］. 甘蔗糖业，2004（5）：1-5.

［21］ Arencibia A D，Carmona E R，Tellez P，et al. An efficient protocol for sugarcane（Saccharum spp. L.） transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens［J］. Transgenic Research，1998，7（3）：213-222.

［22］ Enríquez-Obregón G A，Vázquez-Padrón R I，Prieto-Samsonov D L，et al. Herbicide-resistant sugarcane（Saccharum officinarum L.） plants by Agrobacterium mediated transformation［J］. Planta，1998，206（1）：20-27.

［23］ 滕崢，李鸣，崔永祯，等. 农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立［J］. 南方农业学报，2014，45（8）：1333-1339.

［24］ Matsuoka M，Ideta O，Tanio M，et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of sugarcane using cell suspension culture with a novel method［J］. International Society of Sugar Cane Technologists，2001：660-662.

［25］ 李晓梅，王闵霞，秦廷豪，等. 根癌农杆菌介导甘蔗遗传转化Bt（cry1Ab）基因［J］. 生物技术通报，2013（2）：100-105.

［26］ Fuchs R L，Ream J E，Hammond B G，et al. Safety assessment of the neomycin phosphotransferase II（NPTII） protein［J］. Nature Biotechnology，1993，11（12）：1543-1547.

［27］ Joyce P，Kuwahata M，Turner N，et al. Selection system and co-cultivation medium are important determinants of Agrobacterium-mediated transformation of su-garcane［J］. Plant Cell Reports，2010，29（2）：173-183.

［28］ Joyce P，Hermann S，OConnell A，et al. Field performance of transgenic sugarcane produced using Agrobacterium and biolistics methods［J］. Plant Biotechno-logy Journal，2014，12（4）：411-424.

［29］ Bower R，Birch R G. Transgenic sugarcane plants via microprojectile bombardment［J］. The Plant Journal，1992，2（3）：409-416.

［30］ Langridge P，Brettschneider R，Lazzeri P，et al. Transformation of cereals via Agrobacterium and the pollen pathway：A critical assessment［J］. The Plant Journal，1992，2（4）：631-638.

［31］ Franks T，Birch R G. Gene transfer into intact sugarcane cells using microprojectile bombardment［J］. Functional Plant Biology，1991，18（5）：471-480.

［32］ Arvinth S，Selvakesavan R K，Subramonian N，et al. Transmission and expression of transgenes in progeny of sugarcane clones with cry1Ab and aprotinin genes［J］. Sugar Technology，2009，11（3）：292-295.

［33］ Christy L A，Arvinth S，Saravanakumar M，et al. Engineering sugarcane cultivars with bovine pancreatic trypsin inhibitor（aprotinin） gene for protection against top borer（Scirpophaga excerptalis Walker）［J］. Plant Cell Reports，2009，28（2）：175-184.

［34］ Rathus C，Birch R G. Stable transformation of callus from electroporated sugarcane protoplasts［J］. Plant Scien-ce，1992，82（1）：81-89.

［35］ 張树珍，郑学勤. 基因枪介导甘蔗遗传转化研究初报［J］. 热带作物学报，2001，22（1）：35-41.

［36］ Kalunke R M，Kolge A M，Babu K H，et al. Agrobacterium mediated transformation of sugarcane for borer resistance using Cry 1Aa3 gene and one-step regeneration of transgenic plants［J］. Sugar Technology，2009，11（4）：355-359.

［37］ Arvinth S，Arun S，Selvakesavan R K，et al. Genetic transformation and pyramiding of aprotinin-expressing sugarcane with cry1Ab for shoot borer（Chilo infuscatellus） resistance［J］. Plant Cell Reports，2010，29（4）：383-395.

［38］ Gallois P，Lindsey K，Malone R. Electroporation of tobacco leaf protoplasts uusing plasmid DNA or total genomic DNA［J］. Plant Cell Electroporation and Electrofusion Protocols，1995：89-107.

［39］ Negrutiu I，Shillito R，Potrykus I，et al. Hybrid genes in the analysis of transformation conditions［J］. Plant Molecular Biology，1987，8（5）：363-373.

［40］ 乐花花，鲍益娟，周小明. CRISPR/Cas9运载体的研究进展［J］. 激光生物学报，2017，26（6）：490-494.

［41］ 薛菲，孙春玉，蒋世翠，等. 植物转基因技术及其应用［J］. 吉林蔬菜，2014（5）：39-41.

［42］ Chen W H，Gartland K M A，Davey M R，et al. Transformation of sugarcane protoplasts by direct uptake of a selectable chimaeric gene［J］. Plant Cell Reports，1987，6（4）：297-301.

［43］ Miao J，Guo D，Zhang J，et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system［J］. Cell Research，2013，23（10）：1233-1236.

［44］ Wang Y，Cheng X，Shan Q，et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew［J］. Nature Biotechnology，2014，32（9）：947-951.

［45］ 邢慧丽. CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用［D］. 北京：中国农业大学，2017.

［46］ Shan Q，Wang Y，Li J，et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system［J］. Nature Biotechnology，2013，31（8）：686-688.

［47］ Waltz E. Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation［J］. Nature，2016，532（7599）：293.

［48］ 王延鹏，程曦，高彩霞，等. 利用基因组编辑技术创制抗白粉病小麦［J］. 遗传，2014，36（8）：848.

［49］ Zhou H，He M，Li J，et al. Development of commercial thermo-sensitive genic male ssterile rice accelerates hybrid rrice breeding using the CRISPR/Cas9-mediated TMS5 editing system［J］. Scientific Reports，2016，6（1）：37395.

［50］ Shi J，Gao H，Wang H，et al. ARGOS8 variants genera-ted by CRISPR-Cas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions［J］. Plant Biotechnology Journal，2017，15（2）：207-216.

［51］ 潘大仁. 生物技术在甘蔗品种改良上应用现状与展望［J］. 甘蔗，2001，8（1）：15-20.

［52］ Alwala S，Kimbeng C A. Molecular genetic linkage map in Saccharum：Strategies，resources and achievements［M］. New Hampshire：Science Publishers，2010.

［53］ Andru S，Pan Y，Thongthawee S，et al. Genetic analysis of the sugarcane（Saccharum spp.） cultivar ‘LCP 85-384. I. Linkage mapping using AFLP，SSR，and TRAP markers［J］. Theoretical and Applied Genetics，2011，123（1）：77-93.

［54］ Ma C，Wu R，Wu S S，et al. Linkage mapping of sex-specific differences［J］. Genetical Research，2002，79（1）：85-96.

［55］ 劉新龙，毛钧，陆鑫，等. 甘蔗SSR和AFLP分子遗传连锁图谱构建［J］. 作物学报，2010，36（1）：177-183.

［56］ Oliveira K M，Pinto L R，Marconi T G，et al. Functional integrated genetic linkage map based on EST-markers for a sugarcane（Saccharum spp.） commercial cross［J］. Molecular Breeding，2007，20（3）：189-208.

［57］ Margarido G R A，Pastina M M，Souza A P，et al. Multi-trait multi-environment quantitative trait loci mapping for a sugarcane commercial cross provides insights on the inheritance of important traits［J］. Mole-cular Breeding，2015，35（8）：175.

［58］ Zhao M，Zhou Y，Su L，et al. Expression of pinellia pedatisecta agglutinin PPA gene in transgenic sugarcane led to stomata patterning change and resistance to sugarcane woolly aphid，Ceratovacuna lanigera Zehntner［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，23：7195.

［59］ 周宇明，黄振，段真珍，等. 甘蔗梢腐病菌Fusarium sacchari CYP51基因克隆及遗传转化［J］. 热带作物学报，2021，42（12）：3462-3470.

（责任编辑 陈 燕）