钙对铝胁迫下油茶生长及生理特性的影响

黄丽媛，刘 珍，贾胜波，邓思颖，盛玉香，王 琼

（湖南工业大学城市与环境学院/城镇水安全排放及资源化湖南省重点实验室，湖南 株洲 412007）

【研究意义】铝是地壳中含量最多的金属元素，当其以铝硅酸盐和铝氧化物等形式存在时，对植物和土壤无毒害［1］。随着全球范围内酸雨危害的加重，大量可溶性铝积累增多，并转变为对植物有毒的Al3+形态。铝毒害最先作用于植物根系，抑制其生长，引起根系损伤，从而影响植物对水分和营养的吸收［2］。随着铝胁迫时间的延长，植物的光合作用也会受到影响，叶绿体被膜遭到破坏，碳水化合物合成受到抑制［3］，能够有效清除自由基的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性降低，导致大量积累活性氧，引发膜脂过氧化，降低H+泵活性和Ca2+-ATP 的活性等，最终导致植物细胞死亡［4］，因此，铝毒也被认为是酸性红壤地区限制植物生长和发育的主要因素之一。研究表明，铝毒害机制可能与破坏植物根部细胞膜的结构与功能有关［5］，而植物体内的Ca2+可以稳定细胞膜，调控细胞内生化过程，起到与Al3+相反的作用［6-8］。因此，施钙被众多学者认为是缓解铝毒的一个重要途径［9-10］。同时，Ca2+作为细胞内的第二信使，参与多种生理生化过程及酶活性的调节［11-12］，这对植物在逆境中的应答反应有重要意义。【前人研究进展】伍志权等［13］研究表明，外源钙可以显著提高铝胁迫下水稻根系的抗氧化酶活性，减少丙二醛（MDA）的积累，降低铝对水稻根伸长的抑制；李清华等［14］对甘薯的研究表明，施钙可以显著促进甘薯根系的生长发育，提高叶片叶绿素含量，有效缓解铝胁迫；段小华等［15］对茶树的研究也表明，钙添加可以有效降低茶树对铝的吸收和积累，促进钙、钾、镁、铁和锌等营养元素的积累。【本研究切入点】油茶（Camellia oleiferaL.）是我国重要的木本油料树种，广泛分布在长江以南的酸性红壤区，该区域是典型的富铝化环境。虽然油茶是铝富集植物，但是前期研究表明，高浓度铝也会显著限制油茶的正常生长发育［16］。土壤酸化导致土壤中Al3+浓度升高，严重影响油茶的产量和品质。由前人研究可知，钙在缓解植物铝胁迫方面具有重要作用，但钙能否缓解油茶铝胁迫还未见报道。【拟解决的关键问题】本试验通过研究外源钙对铝胁迫处理下油茶幼苗生长、渗透调节物质和抗氧化酶活性等的影响，以期为揭示钙缓解油茶铝胁迫的生理机制提供理论依据，同时也为生产中钙的施用量提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2021 年5—10 月在湖南工业大学校园内的油茶试验大棚开展（113°11' E、27°82' N），该区域属于亚热带季风性湿润气候，年平均降雨量1 471 mm，年平均气温16～18 ℃。供试材料是普通油茶品种湘林 XCL 15（Camellia oleifera‘XCL 15’）的扦插苗。扦插枝条选自5～10 年生、长势良好、无病虫害的优良母树，选取当年生、半木质化的春梢，将其修剪为约10 cm 长的插穗，扦插于河沙苗床上，进行常规管理。90 d 后，挑选长势基本一致、根系良好的扦插苗（地径3.0±0.5 mm、苗高16.0±1.0 cm），将根系用清水冲洗干净，移植到15 cm × 22 cm 塑料盆中，每盆装细沙3 kg，移植后置于大棚中，保持通风状态，白天气温高时进行适当遮荫处理。在试验开始前进行14 d 预培养，每隔3 d 浇1 次营养液，每盆400 mL，营养液采用 Hoagland 配方（pH 4.2）［17］。待油茶幼苗适应14 d 后，在Hoagland 营养液基础上加入AlCl3作为铝源，加入CaO 作为钙源，进行钙、铝组合处理。根据前期试验结果，油茶幼苗在4 mmol/L 的铝处理下受到铝毒害，因此本试验铝浓度设置为4 mmol/L，同时添加4 个不同浓度钙进行处理，组合成为6 个处理（表1）。每个处理20 盆，每盆2 株。钙、铝处理60 d 后，开始测定油茶植株各项生长和生理指标。

表1 试验处理Table 1 Experimental treatments

1.2 测定指标及方法

生长指标：用游标卡尺和卷尺分别测定油茶幼苗的地径、株高，同时记录叶片数。幼苗收获后，每个处理随机选择5 株油茶幼苗，用纯水冲洗干净，置于烘箱内105 ℃杀青30 min，然后置于烘箱中60℃烘至恒重，记录植株干质量［18］。

光合参数：每个处理选择 5 盆油茶苗，随机挑选其中5 株，每株选择3 片成熟叶，于上午9：00—11：00 采用Li-6400XT 光合仪测定净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）和胞间CO2浓度（Ci）。

生理指标：每个处理随机选取15～20 株，将根系和叶片用蒸馏水洗净并用滤纸擦干水分，测定生理指标。根系活力采用TTC 法［19］测定；叶绿素a、叶绿素 b 和类胡萝卜素含量采用丙酮浸提法［20］测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法［21］测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法［22］测定；游离氨基酸和游离脯氨酸含量分别采用蒸馏水和3%磺基水杨酸提取，均用茚三酮显色法［23］测定；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法［24］测定；质膜透性采用电导率法［25］测定，以相对电导率（前后两次电导的比值）表示；SOD 活性采用氯化硝基氮蓝四唑法［26］测定；POD 活性采用愈创木酚法［27］测定；CAT 活性采用紫外分光光度法［28］测定；APX 活性以抗坏血酸为底物，采用分光光度计测定［17］。

采用Excel 2013 整理数据和制图，SPSS 22.0软件进行均值、标准差计算及方差分析，其中方差分析采用Duncan 法。

2 结果与分析

2.1 钙对铝胁迫下油茶幼苗生长状况的影响

不同浓度钙对铝胁迫下油茶幼苗生长的影响如表2 所示。铝胁迫（CK+Al）处理下，油茶幼苗的地径、株高、植株干质量、叶片数及根系活力均显著下降，分别比对照（CK）下降21.81%、32.32%、34.15%、50.77%和40.92%。添加不同浓度钙处理后，油茶幼苗各项生长指标均呈先上升后下降的变化，在Al+Ca 3.0 处理下缓解铝胁迫的效果最好，地径、株高、植株干质量、叶片数及根系活力分别比铝胁迫（CK+Al）处理提高21.43%、40.69%、40.58%、68.75% 和54.17%，除叶片数外，其余各指标与对照（CK）无显著差异。而在高浓度钙处理（Al+Ca 5.0）下，各生长指标与铝胁迫处理相比无显著差异；低浓度钙处理（Al+Ca 0.5）除植株干质量外，其他生长指标均与铝胁迫处理（CK+Al）无显著差异。

表2 钙对铝胁迫下油茶幼苗生长状况的影响Table 2 Effect of Ca on growth condition of Camellia oleifera seedlings under aluminum stress

2.2 钙对铝胁迫下油茶叶片光合色素含量的影响

由表3 可知，与对照（CK）相比，铝胁迫（CK+Al）处理下油茶叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量分别下降55.49%、58.82%、65.85%和55.74%，下降幅度最大的是类胡萝卜素含量，由此可见铝胁迫对油茶叶片光合色素含量有明显的抑制作用。随着外源钙的施入，油茶叶片光合色素含量均有不同程度的提高，尤其是当钙浓度达到1.5～3 mmol/L 时，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量均显著高于铝胁迫（CK+Al）处理。当钙浓度达到5 mmol/L时，油茶叶片光合色素含量与Al+Ca 3.0 处理相比明显下降，表明该浓度钙处理对油茶光合作用产生一定的抑制作用。

表3 钙对铝胁迫下油茶叶片光合色素含量的影响Table 3 Effect of Ca on photosynthetic pigment content of Camellia oleifera leaves under Al stress

2.3 钙对铝胁迫下油茶叶片光合参数的影响

由图1 可知，与对照（CK）相比，铝胁迫（CK+Al）处理下油茶叶片Pn、Gs、Tr 分别下降32.28%、51.02%和53.91%，表明铝胁迫抑制了油茶的光合作用。适量外源钙的施入均能促进Pn、Gs 和Tr 的上升，尤其是Al+Ca 3.0 处理下，油茶叶片Pn、Gs 和Tr 分别比铝胁迫（CK+Al）上升41.55%、93.75%和76.42%，差异显著。与Pn、Gs 和Tr 相反，油茶叶片Ci 值在铝胁迫下显著提高，较对照（CK）提高20%，施外源钙后Ci反而降低，不同钙浓度处理下Ci 差异不显著。

图1 钙对铝胁迫下油茶叶片光合参数的影响Fig.1 Effect of Ca on photosynthesis parameters of Camellia oleifera leaves under Al stress

2.4 钙对铝胁迫下油茶根系渗透调节物质含量的影响

由表4 可知，铝胁迫（CK+Al）处理显著抑制了油茶根系对可溶性糖和可溶性蛋白的积累，与对照（CK）相比分别下降24.88%和27.06%。添加适量浓度外源钙，可溶性糖含量显著上升，Al+Ca 1.5 和Al+Ca 3.0 处理分别较铝胁迫（CK+Al）提高17.72%和23.00%。外源钙的添加并未缓解铝胁迫对可溶性蛋白的抑制作用，反而降低可溶性蛋白含量，尤其是钙浓度达到3 mmol/L 时，可溶性蛋白含量显著低于铝胁迫（CK+Al）处理。游离脯氨酸和游离氨基酸含量在铝胁迫（CK+Al）下显著提高，其含量是对照（CK）的2 倍和1.2 倍。随着外源钙的施入，游离脯氨酸含量呈先下降后上升的趋势，当钙浓度达到1.5 和3 mmol/L 时，其含量显著降低，分别比铝胁迫（CK+Al）处理下降19.40%和27.03%，而高钙（5 mmol/L）处理下游离脯氨酸含量上升，与铝胁迫（CK+Al）相比差异不显著。外源钙的施入促进了游离氨基酸的积累，当钙浓度达到1.5 和3 mmol/L 时，其含量较对照（CK）分别上升35.81%和38.60%，较铝胁迫（CK+Al）处理上升13.62%和15.95%。

表4 钙对铝胁迫下油茶根系渗透调节物质含量的影响Table 4 Effect of Ca on root osmoregulatory substances of Camellia oleifera roots under Al stress

2.5 钙对铝胁迫下油茶根系MDA 含量和质膜透性的影响

钙铝处理对油茶根系MDA 含量和质膜透性的影响如图2 所示，在受到铝胁迫（CK+Al）后，与对照（CK）相比，MDA 含量和质膜透性分别提高39.25%和29.26%，差异显著，表明油茶根系质膜受到伤害。添加外源钙后，MDA 含量呈现出先下降后上升的变化趋势，与铝胁迫（CK+Al）处理相比，Al+Ca 0.5、Al+Ca 1.5 和Al+Ca 3.0 处理分别下降15.87%、19.52%和31.40%，且差异显著；而Al+Ca 5.0 处理下MDA 含量与铝胁迫（CK+Al）处理无显著差异。油茶根系质膜透性在Al+Ca 0.5、Al+Ca 1.5 和Al+Ca 3.0 处理下呈下降趋势，尤其Al+Ca 1.5 处理下质膜透性值最低，较铝胁迫（CK+Al）下降27.86%；Al+Ca 5.0 处理下油茶根系质膜透性升高，与铝胁迫（CK+Al）处理无显著差异。

图2 钙对铝胁迫下油茶根系MDA 含量和质膜透性的影响Fig.2 Effect of Ca on malondialdehyde content and plasma membrane permeability of Camellia oleifera roots under Al stress

2.6 钙对铝胁迫下油茶抗氧化酶活性的影响

由图3 可知，铝胁迫（CK+Al）处理下油茶根系SOD、POD、CAT 和叶片AXP 活性均显著低于对照（CK），分别下降19.44%、29.85%、50.22%和27.92%。在添加外源钙后，随着钙浓度的升高，油茶根系SOD、POD、CAT 和叶片AXP 活性表现为先上升后下降的变化趋势。在Al+Ca 3.0 处理下SOD 和CAT 活性最高，分别比铝胁迫（CK+Al）提高53.16%和136.77%；在Al+Ca 1.5 处理下，POD 和AXP 活性最高，与铝胁迫（CK+Al）处理相比分别提高36.16%和64.08%；而Al+Ca 5.0 处理下，SOD、POD、CAT 和AXP 活性降低，表明高浓度钙铝处理会抑制油茶抗氧化酶活性。

图3 钙对铝胁迫下油茶抗氧化酶活性的影响Fig.3 Effect t of Ca on antioxidant enzymes activity of Camellia oleifera under Al stress

3 讨论

在强烈的淋溶作用下，酸性红壤地区土壤中大量活性铝被释放，过量活性铝会对植物产生毒害作用［29］，抑制植物根尖细胞的分裂伸长，降低根系活力，阻碍其对养分和水分的吸收积累，甚至使得根系畸形坏死，从而影响植株生长［30］。研究表明，外源钙的施入可以有效缓解铝毒对植物根系的破坏［31］。本试验中，铝胁迫下显著抑制了油茶幼苗的地径、株高、植株干质量、叶片数及根系活力，在添加适当浓度（3 mmol/L）外源钙后，油茶根系活力显著提高，地径、株高、植株干质量等明显增加，表明钙能有效缓解铝胁迫对油茶幼苗生长的抑制作用，这可能是因为Ca2+和 Al3+能够同时被油茶幼苗的根系吸收，存在竞争关系，施钙可以增强Ca2+与Al3+的拮抗作用，提高钙在细胞膜结合位点的竞争力，降低根系对Al3+的吸收和积累，从而起到缓解铝毒的作用［32］。然而当外源钙浓度达到5 mmol/L 时，与铝胁迫相比，油茶幼苗各项生长指标无显著差异，表明外源钙浓度并非越高越好，高浓度钙处理对缓解油茶耐铝毒的作用不大，甚至可能与铝协同产生抑制作用。

光合作用是为植物生长发育提供能量的过程，同时有助于植物积累有机物［33］。光合色素主要参与光能的吸收、转化与传递，是反映植物光合作用的重要指标。叶绿素是最主要的光合色素，其含量高低直接决定光合作用的强弱［34］，类胡萝卜素可以快速淬灭吸收过量光子，产生激发态叶绿素，实现保护功能。郑阳霞等［35］研究发现，Al3+会破坏植物的光合系统，降低叶片叶绿素和类胡萝卜素的含量。当叶绿素含量降低时，天线色素和反应色素捕获、转化光能下降，导致光合速率下降，从而抑制植物的光合作用［36］。在本研究中，铝胁迫下油茶叶片叶绿素和类胡萝卜素含量均显著减少，Pn、Gs 和Tr 明显降低，可见铝胁迫抑制了油茶光合作用。在Pn、Gs、Tr下降的同时，Ci 显著上升，表明非气孔因素是铝胁迫抑制油茶光合速率的主要因素，铝胁迫导致进入叶肉细胞的CO2不能被及时同化，这与渠心静等［17］研究结果一致。施加一定浓度的外源钙（1.5～3.0 mmol/L）可以抑制油茶叶绿素、类胡萝卜素的含量的下降，表明Ca2+有助于维持叶绿体膜结构的稳定性和完整性，从而使叶片保持较高的光合色素。与此同时，随着钙的添加，与铝胁迫处理相比，Pn、Gs 和Tr 升高，而Ci 下降，表明钙的添加可以增强油茶幼苗的光合作用，促进对光能的吸收和利用，这也是油茶植株生物量增加的原因。当钙浓度达到5 mmol/L 时，叶绿素含量、Pn、Gs、Tr 均降低，且与铝胁迫处理无显著差异，表明高钙高铝处理会抑制油茶叶片光合色素合成，降低光合速率，这与王玉凤等［37］研究结果一致。

植物为适应逆境，会通过调节体内的游离脯氨酸、游离氨基酸、可溶性蛋白和可溶性糖等物质来提高其抗逆性。可溶性糖和可溶性蛋白不仅可以为植物提供能量，还可以调节植物体内细胞液浓度以改变渗透势［38］。在逆境中，游离脯氨酸会大量积累，通过降低细胞渗透势来减少细胞液外渗［39］。本研究中，铝胁迫显著降低了油茶根系的可溶性糖和可溶性蛋白含量，而游离脯氨酸和游离氨基酸含量明显上升，在添加1.5～3 mmol/L 钙处理后，可溶性糖和游离氨基酸含量显著提高，游离脯氨酸含量明显下降，可溶性蛋白含量与铝胁迫处理无显著差异。随着外源钙的施加，可溶性糖含量升高可以有效降低油茶根系的渗透势，维持膨压，增强吸水功能，而游离脯氨酸含量的下降也表明此时油茶幼苗所受铝胁迫得到缓解。增加营养液中外源钙浓度，可溶性蛋白、游离氨基酸含量的变化趋势相反，这可能与钙在氮的代谢、合成中所起的作用有关，其具体机制有待进一步研究。

植物在逆境胁迫中细胞膜容易受到破坏，影响其调节和控制胞内和胞外物质运输、交换的功能。研究表明，铝胁迫会导致植物体内产生过多的活性氧自由基（ROS），打破ROS 与抗氧化酶之间的平衡，加快植物体内膜脂过氧化进程，损伤细胞膜系统，导致质膜过氧化，产生MDA，因此，通常用MDA 含量来衡量植物受害程度［40］。本研究结果表明，铝胁迫处理使油茶幼苗根系的MDA 含量和细胞质膜透性增大，而加入1.5～3.0 mmol/L 钙能明显缓解MDA 和质膜透性的增加，表明适量外源钙能抑制膜脂过氧化、降低质膜透性，其原因可能是Ca2+与膜磷脂的极性头部结合发生交联作用，从而使得膜脂上的蛋白质分子和磷脂分子结合紧密，降低细胞膜的透性［41］。由于铝胁迫产生大量ROS，会激发植物自身的保护系统来清除过量ROS，而SOD、POD、CAT 和APX 等抗氧化保护酶可以在植物体内协同作用抵御逆境胁迫。SOD 可以催化超氧阴离子发生歧化反应，POD、CAT 和APX 负责清除歧化过程中产生的H2O2，起到清除和阻止自由基形成的作用，从而维持细胞正常功能［42-44］。有研究表明，施钙有助于提高植物的抗氧化酶活性，增强ROS 的清除能力，防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害［45］，这与本研究结果一致，施钙水平在1.5～3 mmol/L 范围内，SOD、POD、CAT 和APX 活性显著高于铝胁迫处理，并维持在较高水平。但是，铝胁迫的缓解作用与钙浓度有关，低浓度（0.5 mmol/L）效果不大，而钙浓度过高则表现出抑制作用，当其浓度达到5 mmol/L 时，SOD、POD、CAT 和APX 活性呈下降趋势，这可能是高浓度钙铝处理对植物组织细胞产生新的离子伤害，使毒害作用加重，具体原因还需要深入研究。

4 结论

铝胁迫处理显著抑制了油茶幼苗的生长和光合色素合成，减弱光合效率，积累大量的游离脯氨酸和游离氨基酸，MDA 含量和细胞膜透性增大，从而引起氧化胁迫。通过外施3 mmol/L 钙，油茶幼苗的植株干质量和根系活力分别提高40.58%和54.17%，光合色素含量显著提高，Pn、Gs 和Tr 分别上升41.55%、93.75%和76.42%，表明施钙增强了叶片细胞捕获光的能力。同时，钙的施入还提高了可溶性糖含量，降低MDA 含量，促进 SOD、POD、CAT 和APX 活性的提高，从而减轻质膜过氧化程度和活性氧的积累。适宜浓度钙可以有效缓解铝胁迫对油茶的伤害，提高油茶对铝胁迫的耐性，保证油茶正常生长。