纳豆菌发酵海参制备的多糖抗氧化活性分析

鞠念衡，刘 爽，韩之一，李双双，赵前程，3，4，李 莹，3，4*

(1.大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023；2.大连鑫玉龙海洋生物种业科技股份有限公司，辽宁 大连 116299；3.大连民族大学生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116600；4.辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室，辽宁 大连 116023)

海参被誉为“海八珍”之首，是一种高端食材，其保健功效受到广泛认可[1]。目前市场上的海参加工品技术含量低，同质化程度高。而现有的海参精深加工品以酶解技术制备海参肽为主，高品质、高附加值的产品仍然匮乏[2]，目前市场上也没有发酵海参类产品。同时，研究发现人体内过多的自由基会破坏生物膜，产生氧化应激反应，引起多种疾病[3]。海参多糖是海参中重要的功能成分，已被证实具有清除人体内自由基的抗氧化活性[4]。

近些年益生菌市场火热，纳豆菌是一种高产蛋白酶的益生菌，能够有效地降解大分子蛋白质，促进营养物质的吸收利用，并能很好地定殖于肠道，改善肠道微生态[5-6]。利用纳豆菌发酵海参开发新型海参精深加工品，将有利于促进海参加工产业升级转型，但发酵过程伴随着复杂的物质转化，发酵前后海参多糖的含量及活性的变化对发酵工艺在海参加工中的应用具有一定的影响。因此，本文采用分光光度法测定发酵海参制备的多糖和海参多糖的羟自由基(·OH)清除能力、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力、2，2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力和铁还原能力，有针对性地对比纳豆菌发酵海参制备的多糖和海参多糖抗氧化活性，为开发新型发酵海参精深加工产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验所用海参为仿刺参(Apostichopusjaponicus)，购自大连财神岛集团有限公司；无水葡萄糖、DPPH、维生素C(VC)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、三水乙酸钠、半胱氨酸、亚铁氰化钾等，购自天津市大茂化学试剂厂；木瓜蛋白酶，购自索莱宝科技有限公司。

千分之一精密电子天平：济宁市裕泽工业科技有限公司；高压蒸汽灭菌锅：山东创美机械科技有限公司；FC3酶标仪：赛默飞世尔科技公司；恒温培养摇床：上海川一实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 海参多糖的提取

参照Xiong Q等[7]的方法并稍加改动，进行多糖的提取。在100.00 g海参粉中加入4.38 g EDTA、40.80 g三水乙酸钠、2.36 g半胱氨酸、10.00 g木瓜蛋白酶、3 L蒸馏水，充分混匀后60°C水浴反应24 h。离心后取上清液并加入10%CPC溶液，室温下放置24 h；离心取沉淀，将其溶解于1.5 L 2 mol/L NaCl∶乙醇(VNaCl∶V乙醇=100∶15)溶液中，在混合溶液中加入3倍体积95%的无水乙醇，4°C静置过夜；取下层沉淀，用乙醇洗涤3次，采用6 000～8 000 Da透析袋进行透析，冻干即得海参多糖。

1.2.2 发酵海参制备的多糖的提取

取试管斜面上的纳豆芽孢杆菌，接种至LB液体培养基，35°C培养过夜，作为种子液(菌体浓度约为109CFU/mL)，以4%接种量接种至海参发酵培养基(海参粉3.5 g/L，葡萄糖7.5 g/L，121°C高压蒸汽灭菌后备用)，35°C发酵48 h。发酵海参制备的多糖的提取方法同1.2.1海参多糖的提取。

1.2.3 多糖组成成分的测定

采用苯酚硫酸法测定发酵海参制备的多糖和海参多糖的总糖含量[8]；采用凯氏定氮法测定蛋白质含量[9]；采用高温煅烧法测定灰分含量[10]。

1.2.4 DPPH自由基清除率的测定[11]

配制浓度为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL多糖溶液与VC溶液，分别吸取2 mL不同浓度发酵海参制备的多糖溶液和海参多糖溶液，加入2 mL避光保存的0.1 mmol/mL DPPH溶液，充分混合均匀，于25°C水浴条件下，避光反应30 min，在517 nm波长下测定吸光值(Optical density，OD)，以VC作为阳性对照。

(1)

式(1)中：a1为2 mL蒸馏水与2 mL 0.1 mmol/mL DPPH溶液反应的OD值；b1为2 mL样品与2 mL 0.1 mmol/mL DPPH溶液反应的OD值；c1为2 mL样品与2 mL 95%乙醇反应的OD值。

1.2.5 羟自由基清除率的测定[12]

配制浓度为2、4、6、8和10 mg/mL的多糖溶液与VC溶液，分别吸取1 mL不同浓度发酵海参制备的多糖溶液和海参多糖溶液，依次加入3 mL 2 mmol/L FeSO4溶液、3 mL 6 mmol/L水杨酸溶液和3 mL 1 mmol/L H2O2溶液，充分混匀后，于37°C水浴条件下反应30 min，在510 nm波长下测定OD值，以VC作为阳性对照。

(2)

式(2)中：a2为以蒸馏水为空白对照的OD值；b2为样品的OD值；c2为以蒸馏水代替H2O2溶液作为本底的OD值。

1.2.6 铁还原力的测定[13]

配制浓度为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的多糖溶液与VC溶液，分别吸取不同浓度发酵海参制备的多糖溶液和海参多糖溶液0.2 mL，加入0.5 mL PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH=6.6)和1%亚铁氰化钾溶液0.2 mL，在60°C水浴中处理30 min，水浴后，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液并离心。取0.5 mL上清液，加入0.1 mL 0.1%的三氯化铁溶液，再加入0.5 mL蒸馏水，充分混匀后静置10 min，在700 nm波长下测定OD值，以VC作为阳性对照。

铁还原力=a3-b3

(3)

式(3)中：a3为样品的OD值；b3为以蒸馏水为空白对照的OD值。

1.2.7 ABTS自由基清除能力测定[14]

配制浓度为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的多糖溶液与VC溶液，分别吸取0.5 mL不同浓度发酵海参制备的多糖溶液和海参多糖溶液，加入0.8 mL ABTS溶液，充分混匀后静置6 min，在700 nm波长下测定OD值，以VC作为阳性对照。

(4)

式(4)中：a4为样品的OD值；b4为以无水乙醇为空白对照的OD值。

1.3 数据处理

所有实验均设置3个平行，数据处理采用Excel 2010进行统计学分析，P<0.05为差异显著；画图采用OriginPro 8.5.1软件。

2 结果与分析

2.1 发酵海参制备的多糖和海参多糖的组成成分分析

对发酵海参制备的多糖和海参多糖进行提取，分析发酵海参制备的多糖和海参多糖的组成成分，结果如表1所示。发酵海参制备的多糖和海参多糖蛋白质含量分别为14.87%和13.64%，总糖含量分别为51.91%和49.09%，发酵海参制备的多糖和海参多糖的组成成分无显著性差异(P>0.05)。

表1 发酵海参制备的多糖和海参多糖的成分分析Tab.1 The composition analysis of polysaccharide from fermented sea cucumber and sea cucumber

2.2 DPPH自由基清除能力比较

由图1可以看出，VC在较低的浓度下就表现出很强的DPPH自由基清除能力，海参多糖与发酵海参制备的多糖的DPPH自由基清除能力均随多糖浓度的升高而增强，呈明显的量效关系，但是均显著低于VC(P<0.05)。在多糖浓度为1.0 mg/mL时，海参多糖与发酵海参制备的多糖的DPPH自由基清除能力分别为73.92%和38.11%，发酵海参制备的多糖对DPPH自由基的清除能力显著低于海参多糖(P<0.05)。海参多糖的抗氧化活性与其结构息息相关，分子量降低可能降低其抗氧化活性，有研究表明，大分子量的海地瓜粗多糖在同等浓度下表现出最强的DPPH自由基和羟自由基清除能力[4]，推测发酵降低了海参多糖的分子量，因而发酵海参制备的多糖的DPPH自由基清除能力降低。

2.3 羟自由基清除能力比较

由图2可以看出，VC在较低的浓度下就表现出很强的羟自由基清除能力，发酵海参制备的多糖和海参多糖的羟自由基清除能力均随多糖浓度的升高而增强，呈明显的量效关系，但是均显著低于VC(P<0.05)。在多糖浓度为1.0 mg/mL时，海参多糖与发酵海参制备的多糖的羟自由基清除能力分别为51.72%和45.94%，发酵海参制备的多糖对羟基自由基的清除能力显著低于海参多糖(P<0.05)。分子量与DPPH自由基和羟自由基清除能力成反比，推测发酵降低了海参多糖的分子量，导致发酵海参制备的多糖的羟自由基清除能力降低。秦裕景等[15]的研究表明，在浓度为4 mg/mL时，VC和从球参中分离出的粗多糖PPP的羟自由基清除率分别为95.14%和30.76%。本文发酵海参制备的多糖和海参多糖羟自由基清除率虽然低于VC，但高于球参的羟自由基清除率。

2.4 铁还原力比较

由图3可以看出，当浓度为0.2～0.4 mg/mL时，VC的铁还原能力随浓度的增加而显著增强(P<0.05)，在0.4 mg/mL之后逐渐趋于饱和。发酵海参制备的多糖和海参多糖的铁还原能力均接近于0，说明发酵海参制备的多糖和海参多糖均没有铁还原能力，而且两者之间无显著性差异(P>0.05)。魏婉露对扇贝废弃液粗多糖的铁还原力进行研究，结果表明其铁还原力为0.148，仅为VC铁还原力的10%[16]。海参多糖与扇贝废弃液粗多糖同样具有糖醛酸，推测含糖醛酸的多糖普遍不具有铁还原力。

2.5 ABTS自由基清除能力比较

由图4可以看出，在较低的浓度下，VC的ABTS自由基清除能力就接近95%。随着浓度的增加，发酵海参制备的多糖和海参多糖的ABTS自由基清除率也随之升高，在浓度为1.0 mg/mL时，海参多糖和发酵海参制备的多糖的ABTS清除率分别为9.57%和14.90%，发酵海参制备的多糖对ABTS自由基的清除能力显著大于海参多糖(P<0.05)。多糖的ABTS自由基清除能力与其含有的官能团有着密切的关系，如羧基或乙酰基[17]，推测发酵使海参多糖的官能团发生改变，因此发酵海参制备的多糖的ABTS自由基的清除能力较未发酵的高。

3 结论

纳豆菌发酵海参制备的多糖和海参多糖均有抗氧化活性，但程度不同，其中发酵海参制备的多糖的羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力低于海参多糖，ABTS自由基清除能力高于海参多糖；两种多糖均没有铁还原能力。发酵海参制备的多糖和海参多糖的含量及组成无明显变化，发酵海参制备的多糖仍具有一定抗氧化活性，说明发酵可以用于海参加工。本研究为新型发酵海参精深加工产品的开发与应用提供了科学依据。