斜带石斑鱼CCR6a基因的克隆、表达模式及抗病毒能力研究

汪 慧，何学泓，秦 洲，赵培杏，张敏琳，黄枫淇，段旭琢，贾弦泽，梁凯珊，赵会宏，冯春元，孙佩银，戴远棠，王 庆*

(1.华南农业大学海洋学院，广东 广州 510642；2.东源县现代农业综合服务中心，广东 河源 517575；3.广东海元农业科技有限公司，广东 阳江 529823)

趋化因子是一种趋化性细胞因子，在炎症和生理条件下对细胞运动和激活起重要作用[1-3]。趋化因子超家族也是连接先天性免疫和获得性免疫的重要桥梁[4-5]。它们参与了脊椎动物神经发育、血管生成、器官生成、生殖细胞迁移和缺氧反应等过程[6-13]。趋化因子受体是一种G蛋白偶联受体，包含了7个跨膜结构[14]，根据受体N-端附近半胱氨酸残基的间距，可以将这些受体分为4个亚家族(CXC、CC、CX3C和XC)[15]。同时，趋化因子超家族包括大量的配体，大多数趋化因子可与多个受体结合，一个受体也可与多个趋化因子结合[16]。虽然趋化因子及其受体在哺乳动物，尤其是人类中得到了广泛的研究，但趋化因子受体在硬骨鱼尤其在鱼类免疫中的作用尚不明确。

CCR6是一种G蛋白偶联受体，表达于多种免疫细胞类型，包括未成熟的树突状细胞(DCs)、固有淋巴样细胞、调节性CD4 T细胞、Th17细胞和B细胞[17-21]。在人类中，CCR6已被证实在抵抗疾病中发挥重要作用，尤其在人类免疫缺陷病毒感染疾病中发挥关键作用[22]，但是在鱼类中关于CCR6的作用还不清楚，尤其是CCR6在鱼类病毒感染中的作用尚未被研究。

斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)，属于鲈形目(Perciformes)、科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae)、石斑鱼属(Epinephelus)，为广盐性暖水性中下层鱼类，主要分布于太平洋和印度洋的热带及亚热带海区。石斑鱼是中国重要的海洋经济鱼类养殖品种。然而，近年来各种病毒性疾病的暴发影响了石斑鱼养殖的发展[23]，尤其是赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)，受其感染会导致超过90%的鱼苗死亡。本研究克隆了斜带石斑鱼CCR6a基因ORF序列，并分析了该基因的进化关系，通过基因过表达和RT-qPCR方法研究了该基因组织分布、亚细胞定位和抗病毒功能，发现CCR6a可显著抑制RGNNV的复制。由于CCR6在抗病毒免疫反应中发挥着重要作用，因此研究CCR6与抗RGNNV之间的关系将有助于防治该病毒病。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

本实验所用斜带石斑鱼来自广东省阳江市广东海元农业科技有限公司养殖基地，挑取3尾体质量在500～750 g之间的健康鱼，取样前对鱼进行麻醉处理，取肝、脾、垂体、头肾、下丘脑、肾、性腺、肌肉、鳃、肠、皮肤和心脏组织于液氮中速冻，置于-80℃超低温冰箱中保存，用于RNA提取、基因克隆和组织表达研究。

1.1.2 细胞实验

研究中使用的石斑鱼脾脏(GS)细胞是本实验室前期培育的石斑鱼脾脏细胞系。RGNNV是实验室前期分离、培养和保存的病毒。用RGNNV感染GS细胞一定时间，在感染后的特定时间点，收集病毒感染的细胞并进行分析。

1.2 CCR6a基因ORF区域的克隆和分析

1.2.1 总RNA提取

采用 Trizol reagent 说明书及操作步骤来提取总 RNA，采用cDNA合成试剂盒(罗氏)反转录成 cDNA 模板，用于基因克隆和实时定量 PCR。

1.2.2 引物设计

从斜带石斑鱼基因组数据库中获取CCR6a核心序列信息，结合NCBI数据库获得已报道的鱼类CCR6基因序列进行分析，使用Primer 5.0在线引物搜索工具设计CCR6a基因ORF区域引物，引物序列为CCR6a-F：GATGAACTACACCAACCAATC，CCR6a-R：CCTCACATGGTGAAAGATGAGC (表1)。

1.2.3 CCR6a 基因的克隆与分析

用反转录出来的cDNA为模板，采用设计的引物进行聚合酶链式反应来克隆CCR6a的ORF序列。琼脂糖凝胶电泳验证后，用胶回收试剂盒 (Omega Bio-Tek，USA)回收目的条带，对回收产物进行连接转化和菌液验证，将验证后的菌液送至擎科生物科技有限公司进行测序。测序结果出来后，CCR6a的氨基酸序列利用 BioEdit 软件翻译，CCR6a蛋白序列的多重比对和进化树分析使用ClustalW 1.83和MEGA 5.0软件进行。

1.2.4 表达载体的构建

将CCR6a亚克隆到pEGFP-C1表达载体中，研究CCR6a在石斑鱼GS细胞中的定位和潜在功能。pEGFP-C1表达载体购买自Takara公司(货号：PT3028-5)，GS细胞来自本实验室前期构建的石斑鱼脾脏细胞系，质粒构建的引物如表1所示，pEGFP-C1-1F：CCGGAATTCTATGAACTACACCAACCAATCAG，pEGFP-C1-1R：CGGGGTACCCATGGTGAAAGATGAGCCGTTTTC。采用双酶切方法将CCR6a的ORF区连接到载体，采用的两种酶是ECORI和KPNI，酶切位点在引物序列中标粗，重组质粒经DNA测序证实。

1.2.5 细胞定位分析

1×105GS细胞加入6孔板中，培养24 h后，采用Invitrogen 公司的Lipofectamine 2000 (货号：11668-019)转染试剂将pEGFP-C1和pEGFP-CCR6a质粒转染入GS细胞中，继续培养48 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，然后用1 mg/mL DAPI染核10 min，最后用PBS冲洗细胞，50%甘油固定，荧光显微镜观察CCR6a的定位情况。

1.2.6 病毒感染实验

本研究中使用的石斑鱼GS细胞培养在添加10%胎牛血清(FBS)的Leibovitz’ L 15培养基中，培养24 h后将细胞传到24孔板中，24 h后将pEGFP-C1和pEGFP-CCR6a质粒转染到GS细胞中，转染完后12 h，用RGNNV感染GS细胞24 h，再收集病毒感染的细胞，提取RNA，通过实时荧光定量分析病毒基因的表达量。

1.2.7 实时定量 PCR 及数据分析

使用SYBR Green I Master(罗氏)在罗氏LightCycler 480实时PCR系统上进行实时PCR分析。PCR条件如下：95℃活化5 min，然后在95℃ 20 s、58℃ 20 s和72℃ 20 s下循环40个周期。定量引物如表1所示，其中引物qCP-F/R表示RGNNV衣壳蛋白基因(Capsid protein，CP)定量引物，qRdRp-F/R 表示RGNNV RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，以β-actin基因作为内参，表1中β Actin-F/R所示为内参引物。分析溶解曲线，确定RT-qPCR的质量，用Excel表格初步处理数据，再利用Graphpad Prism 5.0软件对数据进行处理和分析。

表1 CCR6a基因克隆和RT-qPCR所用引物Tab.1 Primers used for CCR6a gene cloning and RT-qPCR

2 结果与分析

2.1 斜带石斑鱼CCR6a基因克隆及其序列分析

测序结果表明CCR6a包含ORF的cDNA序列，ORF长为1 131 bp，编码376个氨基酸(图1)。用TMHMM Server V.2.0分析得到7个跨膜区域(Transmembrane domain，TM)，分别为TM1(AA39～61)、TM2(AA70～92)、TM3(AA112～134)、TM4(AA147～169)、TM5(AA223～245)、TM6(AA258～277)和TM7(AA306～323)。

NetPhos 2.0 Server预测CCR6a氨基酸序列有36个磷酸化位点、17个丝氨酸磷酸化位点、12个苏氨酸磷酸化位点和7个酪氨酸磷酸化位点。NetNGlyc 1.0 Server预测CCR6a氨基酸序列有8个糖基化位点，其中有1个位于跨膜结构区域内(AA274)，1个位于胞内的C末端区域(AA370)。

2.2 CCR6a氨基酸序列的系统进化树分析

进化树分析结果显示，斜带石斑鱼CCR6a基因与硬骨鱼类的CCR6a基因聚为一支，进一步分析发现 CCR6a与鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)的CCR6a聚为一支(图2)。进化树中选取的相关物种及其基因在 GenBank 的序列号构建进化树所用的基因的序列号如下：CCR6aEpinepheluslanceolatus，XP_033504450.1；CCR6aPercafluviatilis，XP_039637708.1；CCR6aSebastesumbrosus，XP_037605863.1；CCR6aAcanthopagruslatus，XP_036943380.1；CCR6aHippoglossusstenolepis，XP_035006979.1；CCR6aMoronesaxatilis，XP_035534502.1；CCR6aSanderlucioperca，XP_031171690.1；CCR6aGymnodracoacuticeps，XP_034057877.1；CCR6aAmphiprionocellaris，XP_023129801.1；CCR6aPungitiuspungitius，XP_037305948.1；CCR6aThalassophryneamazonica，XP_034018486.1；CCR6aPseudochaenichthysgeorgianus，XP_033935746.1；CCR6aNotolabruscelidotus，XP_034555014.1；CCR6aGasterosteusaculeatusaculeatus，XP_040025791.1；CCR6aOreochromisaureus，XP_031603377.2；CCR6aNeolamprologusbrichardi，XP_006793517.1；CCR6a CCR6aNematolebiaswhitei，XP_037541943.1。

注：阴影表示七次跨膜区域，*表示终止密码子。Notes：The shadow indicated the seven-degree transmembrane region，and *indicated the termination codon.

注：斜带石斑鱼CCR6a氨基酸序列与其他物种的同源序列构建的系统进化树。进化树通过MEGA-X的邻接(N-J)法构建，以最大似然法重复1 000次。Notes：Phylogenetic tree using CCR6a amino acid sequences of orange-spotted grouper and homologous sequences of other species.The tree was constructed by the neighbor-joining method of MEGA-X and repeated 1 000 times by the maximum likelihood method.

2.3 CCR6a基因在斜带石斑鱼不同组织中的表达

通过定量PCR检测CCR6a在不同组织中的表达水平，结果如图3所示，CCR6a基因在斜带石斑鱼的肾脏和鳃中表达量较高，皮肤次之，性腺和肝脏中表达较少。从中可看出，CCR6a基因在免疫组织和非免疫组织的表达水平表现出明显差异，其在免疫组织中的表达水平远高于非免疫组织。

2.4 CCR6a基因在细胞中的定位

构建斜带石斑鱼CCR6a基因的pEGFP-C1载体，通过转染，将带有EGFP标签的CCR6a融合蛋白转染到GS细胞中，以pEGFP-C1的空载体作为对照，在荧光显微镜下观察，结果表明pEGFP-C1转染GS后表达的EGFP在细胞核和细胞质中均有分布；而pEGFP-CCR6a转染的GS细胞中表达的CCR6a存在于细胞的膜系统中(图4)。

2.5 体外验证CCR6a基因抗病毒能力

为确定CCR6a在RGNNV复制中的作用，本研究将CCR6a转染GS细胞，然后用RGNNV感染GS细胞。RGNNV感染后，与对照载体转染的细胞相比，RGNNV感染的CCR6a过表达细胞中RGNNV CP(图5A)和RdRp(图5B)基因的表达量显著降低。这些数据表明CCR6a对RGNNV感染具有抵抗作用。

3 讨论

本研究通过克隆获得斜带石斑鱼CCR6a基因ORF序列，其序列全长为1 131 bp，编码376个氨基酸，通过TMHMM Server V.2.0预测含有7个跨膜结构域，具有G蛋白偶联受体的典型特征。斜带石斑鱼CCR6a序列与其他物种同源性分析发现，斜带石斑鱼CCR6a与大多数鱼类的同源性比较高。系统进化树分析表明斜带石斑鱼CCR6a与鞍带石斑鱼聚为一支。组织表达分析显示，CCR6a在肾脏、鳃和皮肤等免疫组织中有较高的表达。在斑马鱼(Daniorerio)中，CCR主要在大脑和免疫系统中表达[24]；在大西洋鲑(Salmosalar)中，CCR在脾脏和鳃中表达最高[25]；在虹鳟(Oncorhynchusmykiss)中，CCR表达水平最高的部位是胸腺和脾脏[26]，本研究发现的CCR6a在肾脏、鳃和皮肤中高表达，与其他鱼类中关于CCR在免疫器官高表达结果一致。这些研究结果表明，鱼类CCR可能在免疫调节中发挥重要作用。近年来趋化因子受体在脊椎动物免疫应答中的作用备受关注[25，27]，已有许多研究表明趋化因子受体CCR6与机体的各类疾病有着密切的联系[28-31]，但是关于趋化因子在鱼类中的免疫反应，尤其是对病原入侵中的作用知之甚少，因此了解趋化因子受体在鱼类病原体防御中的作用至关重要。

在鱼类中，有研究表明CCR6a对抵抗细菌和寄生虫的感染有重要作用，在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)中，CCR6a对减少杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)感染有重要作用[32]，在斜带石斑鱼中发现CCR6可能在刺激隐核虫引起的炎症时免疫细胞向皮肤黏膜免疫组织的归化过程中发挥重要作用[33]。前期研究表明CCR在细菌和寄生虫感染中起着重要作用，而CCR6a作为CCR家族中的重要成员，在病毒感染中也起着重要作用。在人类中，有研究表明CCR6作为一种新的辅受体参与HIV和SIV毒株的入侵[34]，此外CCR6/CCL20趋化因子轴在HIV发病和免疫中发挥重要作用[35]。在鱼类中还没有CCR6与病毒入侵和抗病毒方面的研究，但是有大量研究表明趋化因子家族对鱼类病毒的入侵和抗病毒免疫反应的初始阶段起着重要作用[36-38]。本研究发现在石斑鱼中CCR6a过表达显著抑制RGNNV复制，CCR6a作为膜蛋白可能阻止了病毒的入侵，从而降低病毒在细胞内的总量，也有可能如之前的研究发现，CCR可以通过诱导石斑鱼细胞中IFN调控因子显著增加和提高ISRE、IFN启动子活性，从而提高干扰素生产来抵抗病毒[39]，但是这需要进一步的研究证实。总体来说，本研究结果提示CCR6a可能是鱼类重要的抗病毒因子之一。

鱼类病毒性神经坏死病是由神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)引起的一种全球范围的鱼类流行性传染病。其中，RGNNV主要感染石斑鱼、鲈鱼等海水鱼类，一旦感染，死亡率可达100%，对石斑鱼养殖危害很大[40-42]。本研究探索斜带石斑鱼CCR6a基因的表达及其对RGNNV的作用情况，为斜带石斑鱼的抗病免疫等方面的研究提供一定的基础。近年来，关于鱼类趋化因子及其受体的研究逐渐增多，越来越多的鱼类趋化因子被鉴定报道。目前有许多研究表明CCR6在免疫调节中扮演着重要的角色，探索其作用机制对相关疾病的免疫治疗具有非常重要的意义。

4 结论

本研究从斜带石斑鱼组织中克隆出了CCR6a基因的ORF序列，并对其序列和进化关系进行了分析，同时研究了其组织分布、亚细胞定位和抗病毒情况。结果表明，斜带石斑鱼CCR6a基因ORF序列全长为1 131 bp，编码376个氨基酸；进化树分析发现，斜带石斑鱼CCR6a与同为石斑鱼属的鞍带石斑鱼聚为一支；组织分布研究表明，斜带石斑鱼CCR6a在免疫组织中的表达水平显著高于非免疫组织；利用荧光显微镜对其亚细胞定位分析表明，该基因为膜分布；此外，过表达显著抑制了体外RGNNV的复制。研究结果将有助于理解鱼类趋化因子在病毒感染中的作用。