玉米中真菌毒素检测技术的研究进展

谭 林，陆 阳，王正珅

（1.中央储备粮辽宁质检中心有限公司，沈阳 110034；2.中央储备粮通辽东郊直属库有限公司，辽宁 通辽 028012）

玉米又名玉蜀黍，禾本科一年生草本植物，原产于美洲安第斯山脉， 哥伦布发现美洲大陆后玉米传至欧洲， 于明代传入我国， 在我国的种植历史已有400 多年。 由于玉米富含碳水化合物、脂肪、蛋白质及一些重要的维生素和矿物质，物美价廉，深受消费者喜爱。 玉米是仅次于水稻和小麦的中国第三大谷类作物，通常作为早餐谷物食用，如玉米粉粥、和玉米煎饼， 同时玉米在世界范围内也被广泛用作牲畜饲料，成为人与动物的主要营养谷类作物[1]。

真菌毒素是真菌的次级代谢产物， 是粮食作物的主要污染源之一， 这些次级代谢产物被高等动物摄入时会引起毒性反应， 严重威胁人类及动物的健康[2]。 我国玉米种植面积大、产量高，但其在收获、贮藏期间易受到外界环境因素的影响产生真菌， 其次级代谢产物真菌毒素主要有三种： 黄曲霉B1（AFB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）。在保证粮食安全过程中，对粮食收购时进行真菌毒素检测至关重要[3]。

目前国内外对真菌毒素的检测技术研究主要有酶联免疫吸附法 （ELISA）、 高效液相色谱法（HPLC）、胶体金免疫层析法（CGIA）、近红外光谱法（NIR）等[4]，本文综述了以上几种真菌毒素检测方法，并对其准确度，优缺点做了分析，对其在粮食收购过程中的操作复杂度，时效性进行了评估，以期为真菌毒素检测技术的研究及推广提供理论依据。

1 高效液相色谱法

高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）作为定量检测玉米中真菌毒素最常用的一种方法， 不仅能进行定量检测还可以进行真菌毒素的定性分析。 由于玉米中真菌毒素种类众多，为达到理想的分离效果，减少各毒素之间的影响，所以选择的检测条件也不同。 黄曲霉毒素B1因其产生荧光强度较弱，多采用柱前、柱后衍生，优化其流动相，以此来增强荧光检测信号，从而进行定量检测。 常用的提取溶剂主要有甲醇-水、乙腈-水，可选用的色谱柱有硅胶固相萃取柱、 免疫亲和柱及多功能净化柱， 其中C18是最实用的用于检测真菌毒素的SPE 柱[5]。

在提高检出限和回收率方面， 很多学者探寻了净化柱方面的改良。 黎睿等[6]通过建立免疫亲和柱净化-高效液相色谱法同时测定粮食中黄曲霉毒素B1等8 种真菌毒素， 根据信噪比为3 的峰响应值，确定各真菌毒素的检出限。 样品中各真菌毒素的平均加标回收率， 玉米为80.0%~104.5%， 小麦为83.2%~102.8%，方法精密度为2.6%~10.2%。 李辉章等[7]自制DON 净化柱,采用高效液相色谱法，优化了提取条件，选取乙腈—水溶剂进行提取，通过自制的DON 净化柱净化， 采用C18分离柱和紫外检测器测定。 结果表明：样品通过乙腈—水（体积比为84∶16）混合溶剂和超声20 min 的提取，可大幅度提高方法回收率； 呕吐毒素在0.5～8.0 mg/kg 内线性关系好，相关系数为0.999；在0.5、2.0 和8.0 mg/kg 的加标水平下， 回收率为95.1%～102.3%， 相对标准偏差为1.8%～6.4%，检出限（信噪比）为50 μg/kg。 在玉米零食产品的检测方面， 高效液相色谱也发挥了巨大的作用。Oveisi 等[8]确定了玉米粉中真菌毒素玉米赤霉烯酮（ZEN）的存在并使用具有荧光检测功能的高效液相色谱法分析了38个不同品牌样品（玉米粉和奶酪零食）中的玉米赤霉烯酮。在玉米粉和奶酪零食样品中检测到玉米赤霉烯酮，其平均含量分别为0.377 mg/kg （最大，0.889 mg/kg） 和0.832 mg/kg （最大，1.471 mg/kg）。加标玉米粉和奶酪零食样品的回收率在70%~87%之间。 该方法的检出限为0.01 μg/mL。确定了方法的线性（y= 5.88x+ 0.25，r2= 0.9999），最佳测定范围是0.05~30 μg/mL。

目前高效液相色谱法检测粮食中的真菌毒素以灵敏度、回收率高、准确性强、可检测真菌毒素种类多的优点在科研单位和学校应用广泛， 但由于设备不易携带且检测时间过长，样品前处理方式复杂，对检测人员的素质要求高，检测成本高等原因，无法在中小型粮食企业中进行推广应用， 同时在粮食收购期间， 由于收储量过大， 无法进行大规模的筛选检测、实时和现场分析检测，因此在优化检测程序、降低检测成本等方面有广阔的发展空间。

2 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）最早起源于20 世纪70 年代，是主要用于检测各种生物化学物质的免疫分析方法。 ELISA 分析技术具有快速、简单、准确和灵敏度高等优点，广泛应用于真菌毒素的检测[9]。 国内外许多生物公司制成了ELISA 快速检测真菌毒素试剂盒，采用间接竞争ELISA 方法，使样品中的真菌毒素和抗原竞争毒素抗体， 同时毒素抗体与酶标物相结合，经TMB 底物显色，再进行定量分析即可。

为了提高酶联免疫的敏感度，Zhan 等[10]开发了一种DLS 增强型直接竞争性酶联免疫吸附法（DLSdcELISA）， 用于检测玉米中的黄曲霉毒素B1（AFB1）。 利用羟基自由基诱导的金纳米粒子(AuNP)聚集放大AuNP 散射信号，开发的DLS-dcELISA 对玉米中的黄曲霉毒素B1的检测具有超高灵敏度、高准确度和较强的实用性。同时，在快速检测试剂盒方面酶联免疫方法也取得了很大的进展，Chandra 等[11]利用竞争性酶联免疫吸附技术对从勒克瑙市当地市场收集的印度玉米样品中的黄曲霉毒素发生情况进行了调查， 结果显示真菌数量与黄曲霉毒素含量没有显著关系。 金福源[12]制备了脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体， 成功地建立了可用于DON 检测的ELISA 方法， 为DON 检测试剂盒的开发奠定了基础，优化了DON 检测条件，确立了用于DON 检测的间接竞争ELISA 方法，该检测方法具有良好的重复性，可完全应用于DON 的实际检测中。

虽然酶联免疫吸附法已成为常用的真菌毒素快速检测方法， 但由于目标化合物是真菌毒素而不是抗原， 因此具有类似化学基团的化合物也会与抗体相互作用。这种所谓的基质效应或基质干扰，在检测中常会出现这种情况， 可能会导致样品中的真菌毒素浓度过高或过低影响最终检测结果， 此外酶联免疫吸附法还存在验证不足等问题[13]。 因此，ELISA 方法的精确性仍有待提高。

3 近红外光谱检测法

近红外光谱检测法（Near Infrared Spectrumetry Instrument，NIR）起源于20 世纪50 年代，被广泛应用在谷物、水果、蔬菜、饲料等成分的定量检测，经不断研究探索发现近红外光谱是一种用于检测物质中有机化合物最为实用的光谱方法， 因此在谷物真菌毒素检测中也经常被使用到。 Berardo 等[14]从意大利中北部16个地区收集了280个受自然环境污染的玉米样品。分析所有样品的真菌感染。获得的结果表明，NIR 可以准确地预测被真菌感染的果仁的发生率，特别是被细小镰刀菌感染的果仁的发生率。分别使用玉米粒和玉米粉的校准模型， 可以获得对总体真菌感染和细小镰刀菌百分率的最佳预测能力。 玉米籽粒样品中测得的细小镰刀菌感染与NIR 预测值的散点图证实了这种预测性能（r2= 0.80）。NIR 方法可用于监测收获后玉米中的霉菌污染。Wang 等[15]利用近红外光谱成像系统对健康玉米粒表面的黄曲霉毒素B1（AFB1）污染物进行检测。 通过制备4 种不同的AFB1溶液， 分别在玉米粒表面进行沉积10、20、100 和500 mg/kg。 同时用同样的方法在30个健康玉米粒表面滴加20%的甲醇，作为对照样品。 此外，用150个独立样本作为验证，以此来检验方法的可重复性。 结果表明， 高光谱成像技术配合PCAFDA 方法，可用于检测低至10 mg/kg 浓度的AFB1，并可直接应用于玉米表面，验证准确率为88%。

近年来由于常规检测玉米真菌毒素污染的方法比较耗时，对样品破坏严重，且需要熟练的人员进行操作，因此不可能进行大规模的无损检测、实时和现场分析。 因此， 研究了在400~2 500 nm 光谱范围内的可见-近红外光谱(Vis-NIR)检测技术，以快速和无损的方式测定玉米籽粒上的黄曲霉毒素感染被广泛的应用[16]。 粮食收购期间，由于收购量较大，粮食内的真菌毒素分布不均， 对近红外光谱检测造成了一些难度， 同时近红外光谱技术对真菌毒素含量较低的样品检测时准确度不高，稳定性差，这些问题还有待解决，同时也具很大的发展潜力。

4 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法(Colloidal Gold Immunoassay，CGIA)是一种免疫色谱法，其中纤维素膜用作载体， 抗原抗体反应的高度特异性和胶体金特有的颜色反应进行示踪，显示出肉眼可见的红色条带，胶体金溶液在可见光范围内有单一吸收峰， 因此可以用分光光度计来鉴定胶体金的质量， 从而实现对待测物质的定性或定量分析[17]。

此外， 胶体金免疫层析技术可同时测量多种真菌毒素。 孔德昭[18]利用胶体金免疫层析技术结合制备的五种真菌（脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等）单克隆抗体，优化了胶体金试纸条标记抗体的用量、检测线包被浓度，制备了多重真菌毒素胶体金试纸条，同时也做了大量的验证实验，结果表明多重真菌胶体金试纸条实现了快速、准确、便捷的现场检测。 曹德康等[19]应用胶体金免疫层析法检测谷物中的三种真菌毒素， 优化了胶体金溶液的pH、抗原包被量、金标抗体量，制备了3 种快速检测试纸条检测卡， 以高效液相色谱法检测作为对照实验， 结果表明检测卡的检测结果与高效液相色谱法的检测结果基本一致，检测卡灵敏度高、检测结果准确，室温条件下保存时间长达12个月。 Xiulan 等[20]研究了黄曲霉毒素B1(AFB1)特异性抗体-胶体金探针的制备及其在开发黄曲霉毒素B1快速检测方法中的应用， 同时建立了黄曲霉毒素B1的免疫层析(IC) 分析方法。 该方法可在10 min 内完成分析，与ELISA 法相比,检测时间缩短了6～10 倍。 通过肉眼观察,黄曲霉毒素B1标准溶液的检测下限为2.5 ng/mL 左右,比ELISA 法提高了2 倍。

胶体金免疫层析技术由于其检测时间短、 准确度高、不使用毒素标准品等优势在粮油检测机构、粮食企业被广泛应用。 美国CHARM 公司利用胶体金免疫层析技术研发的一款真菌毒素快检仪， 适用于多种农作物（玉米、小麦、大豆、高粱等），可检测多种真菌毒素且检测方法相同、操作简单、携带便捷，适用于粮食收购期间真菌毒素检测的现场筛查[21]。 此种检测方法虽适用于真菌毒素现场筛查， 但其检测成本较高，同时在对潮粮检测时结果准确性不高，容易出现假阳性、假阴性的情况[22]，在广大农户中很难进行推广。

5 结论

真菌毒素对农业和食品产品的污染易导致一系列的食品安全问题，影响人类健康。大多数真菌毒素具有热稳定性，不易被传统的食品加工方式破坏，所以提高真菌毒素的检测水平非常重要。 上述各种真菌毒素检测方法各有优缺点， 随着检测技术不断地深入研究， 结合当前的各项检测技术开发一种检测时间短、操作简单、准确性高、检测成本低、可推广性强的检测方法将是今后真菌毒素检测的发展方向。