芥菜生物熏蒸对烟草疫霉菌的抑制作用*

孙 迪,贺依琳,沈丹宇,窦道龙,田月娥,**

(1.河南科技大学园艺与植物保护学院 洛阳 471000; 2.南京农业大学植物保护学院 南京 210095)

烟草黑胫病(Phytophthora parasiticavar.nicotianae)是由烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)引起的重要土传病害,俗称“穿大褂” “腰烂病”。该病广泛分布于我国各大烟区,是我国烟草(Nicotiana tabacum)上最具毁灭性的病害之一[1]。烟草黑胫病是多循环病害,在一个生长季节可以发生多次接种体的产生和侵染循环,因此接种体的传播在烟草黑胫病的流行过程中发挥着重要的作用。田间条件下,包括游动孢子、孢子囊和菌丝体等在内的多种菌体形式在病害的传播和再侵染过程中都起着重要的作用。烟草疫霉菌通过有性繁殖产生的卵孢子在土壤中可以越冬,是田间发病的重要初侵染源,在病害发展中起着同样重要的作用[2]。长期以来,防治烟草黑胫病主要靠农业措施和化学防治等手段。但由于化学农药的滥用和不科学使用,以及烟草品种的单一性种植等原因,产生了很多环境污染、农残超标和烟草抗病品种退化等尖锐问题[3]。因此,迫切需要探索并寻求安全和环境友好的病害绿色防控方式。

一些植物或微生物及其衍生物能够产生对病原菌、害虫或杂草等有害生物具有抑制作用的挥发性气体,利用这些气体可以达到控制作物病虫草害的目的[4]。其中,十字花科(Brassicaceae)植物富含硫甙类次生代谢物(glucosinolates,GSLs),这类化合物一般储存于细胞的液泡中,其化学性质稳定,无生物活性。但在植物组织翻耕到土壤或细胞被破坏后,游离出的黑芥子酶(myrosinases)启动硫甙水解过程,生成异硫氰酸酯(isothiocyanates,ITCs)[5]。ITCs 是具有抑制作用的挥发性气体,能够有效抑制甚至杀死线虫、病原真菌与卵菌、细菌以及害虫等有害生物,比如十字花科芸薹属(Brassica)植物组织翻到小麦(Triticum aestivum)田,发现能够减少小麦全蚀病菌的数量,起到病害防治目的[6]。因此在前后茬作物种植间隙,种植高硫甙十字花科植物,翻耕深埋后,随着植物的腐烂持续产生大量的ITCs,可以显著降低土壤中有害生物的基数,从而达到病害有效防控的目的,该技术称为生物熏蒸(biofumigation)。

芥菜(Brassica juncea)属十字花科芸薹属植物,是一种重要的生物熏蒸材料。田间施用不仅可以抑制土传病害的发生,还可改变微生物的土壤群落结构,提升肥力[7-8]。同时,对采后果蔬进行熏蒸,可减缓草莓(Fragaria×ananassa)和猕猴桃(Actinidiachinensis)果实采后腐烂,而不会影响果实外部形态和抗氧化指标[9-10]。因此,芥菜在生物防治植物病虫害方面具有巨大的应用前景。但是,由于不同熏蒸材料所含的硫代葡萄糖苷含量差异大,因此,生物熏蒸的效果主要取决于生物熏蒸材料。项目组前期从200 余份芥菜地方资源化材料中筛选出一份硫甙含量高、生物量大、适应性强且生物熏蒸效果好的芥菜型油菜,将其暂命名为‘地隆1 号’(DL1),且发现,‘地隆1 号’芥菜鲜物质对引起水果腐烂病的葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)、辣椒疫霉(P.capsici)及烟草疫霉菌(P.nicotianae)的菌丝生长均具有很好的抑制作用。然而,有关其抑菌机理尚不明确。

为了进一步分析‘地隆1 号’芥菜鲜物质对烟草疫霉菌的抑制作用,本研究以‘地隆1 号’芥菜和烟草疫霉菌Pp025 为研究对象,从‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌丝生长、孢子囊形成和游动孢子释放、孢子萌发及芽管伸长、卵孢子形成、菌丝体细胞膜通透性变化及烟草疫霉菌致病力变化等几个方面来揭示‘地隆1 号’芥菜鲜物质抑制烟草疫霉菌生长发育的作用机制。研究结果可为利用‘地隆1 号’芥菜作为熏蒸材料防控烟草黑胫病提供理论依据,同时将为烟草黑胫病的绿色防控提供新途径。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试病原菌: 烟草疫霉菌P.nicotianae(A2 交配型) Pp025 由南京农业大学植物保护学院植物与疫霉互作实验室惠赠,烟草疫霉菌P.nicotianae(A1 交配型) H1100 由西北农林科技大学农学院卵菌生物学实验室惠赠。

供试芥菜: ‘地隆1 号’芥菜由南京农业大学窦道龙教授课题组选育所得。种子于2020年10月20日播种于河南科技大学开元校区试验地,正常肥水管理,于2021年3月15日左右生长至盛花期时,收获地上部分新鲜组织,经液氮速冻后密封储藏于-20 ℃备用。

供试培养基: 10% V8 固体培养基,100 mL·L-1V8 果蔬汁,碳酸钙0.2 g·L-1,琼脂16 g·L-1,蒸馏水定容至1 L[11]。10% V8 液体培养基同10% V8 固体培养基配方,不加琼脂。水琼脂培养基(WA 培养基)含琼脂16 g·L-1,1000 mL 蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌丝生长影响的测定

参考Serrano-Pérez 等[12]的方法略作修改。采用菌丝生长速率法测定‘地隆1 号’芥菜挥发性物质对烟草疫霉菌丝生长的影响。在生长旺盛的Pp025 菌落边缘打取菌饼(d=5 mm),接种于含有15 mL V8 培养基的固体平板中央。将‘地隆1 号’芥菜鲜株取出后快速于液氮中预冷后破壁粉碎成冻干粉[13],分别称取0 g (对照)、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.6 g 和0.7 g,放置于培养皿内盖中心,立刻用封口膜封口,随后将培养皿置于25 ℃恒温培养箱中黑暗倒置培养[14]。培养3 d 后,用十字交叉法测量菌落直径,计算抑制率、半最大效应浓度(EC50)、75%最大效应浓度(EC75)、最小抑菌量(MIC)。每处理3 次重复。

参考胡安忆[15]的方法略作修改,采用菌丝生长速率法测定‘地隆1 号’芥菜鲜物质非挥发性物质对烟草疫霉菌菌丝生长的影响。 以不添加芥菜作为对照。分别称取1.5 g、2.0 g、2.5 g、3.0 g 和3.5 g 芥菜冻干粉于10 mL离心管中,加入5 mL 无菌水,对照试管中只加无菌水,25 ℃振荡12 h,12 000 rpm 离心20 min,取上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤,添加3 mL 上清液至溶融的50 mL V8 培养基中混匀,同上述方法接菌并培养。每个处理重复3 次。

1.2.2 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌孢子囊形成影响的测定

参考许亚池等[16]的方法,在V8 培养基平板中央接种Pp025 菌饼后,分别称取0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.6 g 和0.7 g ‘地隆1 号’芥菜冻干粉放置于培养皿内盖中心,立刻用封口膜封口,以不添加芥菜作为对照，于28 ℃黑暗培养5 d 后移至28 ℃全光照培养5 d。随后在20×显微镜下随机观察10 个视野,统计平均孢子囊数量。每个处理3 个重复。同时,选择1 处接近平均值的视野进行拍照。观察结束后,在含有孢子囊的培养皿中分别加入15 mL 4 ℃预冷的无菌水,置于4 ℃冰箱30 min,刺激产孢。取出后室温静置1 h,诱导孢子囊释放游动孢子并收集游动孢子悬浮液,通过血球计数板计算游动孢子的浓度。

1.2.3 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌卵孢子形成影响的测定

参考曹继芬等[17]的方法,采用平板对峙培养法测定‘地隆1 号’芥菜对烟草疫霉菌卵孢子形成的影响。将H1100 (A1)和Pp025 (A2)两个不同交配型的标准菌株接于同一V8 培养基平板,两个菌饼相距1.5～2 cm。每个皿中分别加入0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.6 g 和0.7 g 的芥菜粉末,立刻封口。以不添加芥菜作为对照，于25 ℃黑暗培养14 d。随后通过直接镜检计数和匀浆后血球计数板计数两种方法统计卵孢子数量。镜检时在物镜20×显微镜下,每皿选取两个菌饼交界处观察10 个视野并计数; 血球计数板计数时在两个菌饼交界处取2 g 菌丝块,加入30 mL 无菌水进行匀浆。每个处理3 个重复,每个处理统计5次并计算平均值。

1.2.4 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌孢子萌发及芽管伸长影响的测定

在1.2.1 的基础上,参照胡安忆[15]的方法略作修改。用移液枪吸取于对照平板上制备的Pp025 游动孢子悬浮液(105·mL-1) 200 μL,涂布在水琼脂培养基上,每个皿中分别加入0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.6 g 和0.7 g 的芥菜粉末进行熏蒸,每个处理重复3 次。以不添加芥菜作为对照。密封后置于25 ℃黑暗培养,3 h 后在显微镜下观察游动孢子萌发情况,每个重复观察50 个孢子,以芽管长度大于孢子半径为萌发标准。6 h 后,于20×显微镜视野下随机选取5 个孢子测量芽管长度,计算平均芽管长度。

1.2.5 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌细胞膜通透性影响的测定

参考Wang 等[18]的方法,采用DDS-307 雷磁电导仪测定菌丝体电导率。分别从不添加芥菜的对照0 g、EC50值对应的芥菜量熏蒸处理3 d 的Pp025 V8平板上打取5 个菌饼(d=5 mm),放入150 mL V8 液体培养基,25 ℃条件下150 rpm 摇培。分别在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min 和150 min 取样,测定Pp025 培养液体的电导率。待150 min 时间点测完后,将菌丝体煮沸并冷却后再测定最终电导率。每个处理3 个重复。根据以下公式计算相对电导率:

采用分光光度法测定菌丝体丙二醛的含量。在Pp025 菌落边缘打下直径为5 mm 的菌饼10 个,正面朝上放入二分格培养皿中,在培养皿中加入约10 mL V8 液体培养基,使之刚好没过菌丝面,将‘地隆1 号’芥菜冻干粉放置于培养皿另1 格进行熏蒸,设置空白对照和EC50值对应的芥菜量两组处理,每组处理设置3 个重复。25 ℃黑暗培养3 d 后清洗菌丝,用布式漏斗抽干水分后,采用丙二醛含量检测试剂盒(货号: BC0020)测定Pp025 菌丝体内丙二醛的含量。

1.2.6 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质对烟草疫霉菌致病力影响的测定

参考高崇等[19]的方法稍作修改。待普通烟苗第1 片真叶长10 cm 时,剪取自上向下数第3 片叶片,采用离体叶片法进行接种。分别从0 和EC50值对应的芥菜冻干粉量熏蒸处理3 d 的Pp025 平板上取菌饼(5 mm)进行离体叶片侵染,菌丝面朝下紧贴叶片背面,每个处理设置10 个重复。对照为不添加芥菜。在25 ℃光照培养箱(12 h 光照12 h 黑暗)保湿培养3 d 后测量叶片病斑面积并进行拍照。

1.3 数据统计与分析

采用IMAGE J 软件测量叶片病斑面积。采用SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析,采用Duncan 新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸对烟草疫霉菌丝生长的影响

如图1 所示,‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸可明显抑制烟草疫霉菌Pp025 菌丝的生长,且随着芥菜鲜物质量的增多,抑制效果增强,抑制效果与‘地隆1 号’芥菜鲜物质的量呈剂量效应。当芥菜鲜物质的量增加至0.7 g 时,其对Pp025 的抑制率达100%。‘地隆1 号’芥菜鲜物质对Pp025 菌丝生长抑制作用的EC50值为0.362 g,EC75值为0.499 g,最小抑菌量(MIC)为0.5 g。芥菜非挥发性物质对Pp025 菌丝生长无抑制作用(图1)。

图1 不同量‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸对烟草疫霉菌Pp025 菌丝生长的抑制效果Fig.1 Inhibition of mycelium growth of Phytophthora nicotianae Pp025 by fumigation with different amounts of fresh matter of‘DL1’ mustard

2.2 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸对烟草疫霉菌孢子囊形成和游动孢子释放的影响

‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌Pp025 孢子囊形成和游动孢子释放均有强烈的抑制作用。当芥菜鲜物质的量为0.5 g 时,熏蒸处理对Pp025 孢子囊形成和游动孢子释放的抑制率分别达72.8%和86.6%; 当芥菜鲜物质的量增加到0.6 g 时,Pp025 仅形成个别孢子囊,且不能正常释放游动孢子;当芥菜鲜物质的量增加为0.7 g 时,其完全抑制了Pp025 孢子囊的形成(图2)。结果表明,‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理可显著抑制甚至完全抑制烟草疫霉菌孢子囊的产生和游动孢子的释放。

图2 不同量‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸对烟草疫霉菌孢子囊形成和游动孢子释放的抑制效果Fig.2 Inhibition of sporangium formation and zoospore release of Phytophthora nicotianae by fumigation with fresh matter of‘DL1’ mustard

2.3 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸对烟草疫霉菌孢子萌发及芽管伸长的影响

由图3 可看出,‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌Pp025 游动孢子的萌发具有较强的抑制作用。当0 g ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理(CK)的孢子萌发率近90.0%时,0.3 g‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对Pp025 孢子萌发的抑制率达96.5%; 当芥菜鲜物质的量增加为0.4 g 时,其对Pp025 孢子萌发的抑制率为100%。

‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌孢子芽管的伸长同样具有显著的抑制作用。用0.3 g芥菜鲜物质熏蒸处理可显著抑制烟草疫霉菌孢子芽管的伸长,抑制率可达88.8%; 当芥菜鲜物质的量增加至0.4 g 后,完全抑制了芽管的伸长(图3)。结果表明,‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理可对烟草疫霉菌的孢子萌发及芽管伸长起到极显著的抑制作用。

图3 不同量‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸对烟草疫霉菌孢子萌发和芽管伸长的抑制效果Fig.3 Inhibition of spore germination and germ tube elongation of Phytophthora nicotianae by fumigation with fresh matter of‘DL1’ mustard

2.4 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸对烟草疫霉菌卵孢子形成的影响

‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理显著减少了烟草疫霉菌卵孢子的形成数量(图4)。在对峙培养14 d后,CK 产生了大量卵孢子(图4)。然而,经‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理后的Pp025 产生的卵孢子数量显著减少,且减少幅度与芥菜鲜物质的量呈剂量效应。当芥菜鲜物质的量为0.7 g 时,熏蒸处理完全抑制了Pp025 卵孢子的形成。表明‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理可影响烟草疫霉菌的有性生殖,并减少卵孢子的形成数量。

图4 不同量‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸对烟草疫霉菌卵孢子形成的抑制效果Fig.4 Inhibition of oospore formation of Phytophthora nicotianae by fumigation with fresh matter of ‘DL1’ mustard

2.5 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌丝体细胞膜通透性的影响

胁迫导致胞外电导率升高是菌丝体细胞膜破裂的标志之一。如图5 所示,在测定的不同时间段内,处理与对照的相对电导率均有升高趋势。芥菜熏蒸处理组除0 min 外,在其他时间段的相对电导率均高于对照。表明芥菜鲜物质熏蒸处理可破坏烟草疫霉菌的细胞膜通透性。

图5 不同量‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸后烟草疫霉菌细胞膜透性和丙二醛含量的变化Fig.5 Effect of fumigation with fresh matter of ‘DL1’ mustard on cell membrane permeability and malonaldehyde (MDA) content

丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一。如图5 所示,芥菜鲜物质熏蒸处理后,烟草疫霉菌丝体内丙二醛含量显著高于未处理的对照组,说明芥菜鲜物质熏蒸处理可对烟草疫霉菌丝体造成胁迫伤害,引起菌丝体脂质过氧化损伤。

2.6 ‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌致病力的影响

如图6 所示,接种3 d 后,不同处理的烟草叶片发病情况差异明显。其中,阴性对照未发病,阳性对照的烟草叶片出现明显的水渍状病斑,且病斑面积扩展较快(图6)。然而,经‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理后的试验组烟草叶片上没有形成水渍状病斑。表明‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理显著减弱了烟草疫霉菌的致病力。

图6 ‘地隆1 号’芥菜熏蒸处理后烟草疫霉菌Pp025 致病力的变化Fig.6 Variation of infection ability of Pp025 after fumigation of fresh matter of ‘DL1’ mustard

3 讨论和结论

在土传植物病原疫霉菌生活史的所有发育阶段中,孢子囊的产生和游动孢子的释放及萌发为繁殖体数量的快速增加、对寄主的侵染以及病害的发生提供了最大的机会[20]。本研究测定了‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理对烟草疫霉菌丝生长、孢子囊形成和游动孢子释放、孢子萌发及芽管伸长、卵孢子形成、菌丝体细胞膜通透性及致病力的影响,从烟草疫霉菌生长发育、生理生化性状及致病力变化等不同角度探究该物质抑制烟草疫霉菌可能的作用机理。结果表明: 经‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理后,烟草疫霉菌的生长发育、生理生化性状及致病力等均受到明显影响。熏蒸处理后烟草疫霉菌孢子囊和卵孢子的形成数量明显降低甚至被完全抑制,形成的孢子囊释放游动孢子的过程也表现异常,推测‘地隆1 号’芥菜鲜物质产生的异硫氰酸酯类挥发性物质能够有效抑制烟草疫霉菌菌丝的生长代谢,使得菌体代谢减慢,从而抑制菌体的生长发育。研究表明‘地隆1 号’芥菜鲜物质对烟草疫霉菌生长发育的无性繁殖和有性繁殖过程均存在抑制作用。该结果与Wang 等[18]报道的异硫氰酸苄酯能显著抑制链格孢属的孢子萌发和菌丝生长,且破坏细胞膜的完整性的研究结果一致。

细胞膜具有调节和选择物质进出细胞的功能,因此,测定一定条件下细胞膜的通透性对于衡量细胞生理功能至关重要。如果细胞膜受到外界因素的干扰或破坏,将无法有选择地控制细胞内外的物质进出细胞,这将会导致细胞内的各种物质代谢无法正常进行,严重时会导致细胞破裂死亡[21]。本研究中,通过对‘地隆1 号’芥菜鲜物质熏蒸处理后菌丝体相对电导率及膜脂过氧化程度变化的分析,发现熏蒸处理使烟草疫霉菌丝体膜脂过氧化,细胞膜透性逐渐增加,菌丝体内容物泄漏,导致菌丝形态发生改变。推测这可能是‘地隆1 号’芥菜鲜物质产生的异硫氰酸酯类挥发性物质使细胞中电解质大量泄漏,细胞内渗透压不平衡,进而影响菌丝正常的生理结构和功能,最终使得烟草疫霉菌细胞趋于死亡。表明‘地隆1 号’芥菜鲜物质产生的异硫氰酸酯类挥发性物质可以直接通过杀灭烟草疫霉菌起到抑制病菌生长发育的效果。

刘领等[22]研究表明,芥菜提取液能显著抑制烟草黑胫病菌菌丝的生长,增强烟株叶片中防御相关酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)]和抗性相关酶(PAL)的活性,从而达到降低烟草黑胫病的发病率和病情指数的作用。乔世佳等[23]研究发现,小花叶芥菜(B.juncea)提取液能够有效抑制黄瓜枯萎病菌生长,将芥菜经生物熏蒸后施于多年连作黄瓜(Cucumis sativus)的土地,结果表明处理后的黄瓜幼苗株高、茎粗、植株的鲜干重等指标明显优于化学农药处理。马艳等[24]研究发现,以菜粕为生物熏蒸材料进行土壤处理不仅可以有效防控辣椒(Capsicum annum)连作大棚中辣椒疫病的发生,而且可使辣椒增产16.4%。Larkin 等[25]利用芥菜与马铃薯(Solanum tuberosum)轮作显著降低了马铃薯黄萎病的发生率,并使块茎产量提高了12%。病原微生物可以产生细胞壁降解酶以消除植物抗侵染屏障[26]。本研究结果发现,经熏蒸处理后,显著减弱了烟草疫霉菌的致病力,说明‘地隆1 号’芥菜鲜物质产生的挥发性异硫氰酸酯类活性物质有效抑制了烟草疫霉菌产生降解酶的活性,同时降低了烟草疫霉菌分解细胞壁的能力,从而从侵入寄主的角度起到减轻病害发生的作用。这些研究结果为更好地开发和利用芥菜作为生物熏蒸材料应用于农业生产奠定了基础。

生物熏蒸具有无污染、无药害、提高作物产量、改善土壤理化性质等优点,目前,生物熏蒸已成为一种国际上广为使用的植物保护生态调控技术[27]。生物熏蒸的效果主要取决于生物熏蒸材料释放的有毒气体。选择硫代葡萄糖苷含量高的熏蒸材料是提高熏蒸效果最直接有效的方法。本研究中测定的‘地隆1 号’芥菜硫甙含量高、生物量大、适应性强且抑菌谱广,是具有良好发展前景的芥菜型熏蒸材料。实际操作中,除了熏蒸材料本身影响熏蒸效果外,外界环境条件(例如,土壤的理化性质、土壤中的水分含量、温度等)也影响熏蒸的效果。Morra 等[28]研究发现,适宜的土壤湿度可以加大芸薹属植物组织细胞的破碎程度,进而加快异硫氰酸酯的降解速率,提高植物的熏蒸效果。由于熏蒸材料在水解产生异硫氰酸酯的过程需要适量的水,所以利用生物熏蒸材料处理土壤时要确保土壤中水分充足[29]。

因此,本研究从‘地隆1 号’芥菜对烟草疫霉菌的抑制机制出发,通过生物熏蒸的方法,明确了‘地隆1 号’芥菜鲜物质对烟草疫霉菌生长发育各阶段均有不同程度的抑制作用,研究结果为烟草黑胫病的生物防治提供新的思考,为后续工作的开展和深入研究提供理论依据,对生产上综合防控烟草黑胫病和其他土传病害具有重要的实践指导意义和研究价值。