小麦红花间作系统根际微生物群落结构及功能分析*

王香生,连延浩,郭 辉,任永哲,辛泽毓,林同保,王志强

(河南农业大学农学院 郑州 450000)

河南省是我国重要的小麦(Triticum aestivumL.)生产区,2020年河南省小麦种植面积高达567 万hm2,约占总耕地面积的38.48%,是第一大夏粮作物。近年来,在国家农业供给侧结构性改革的背景下,种植业呈多样化和高效化的发展趋势,在河南中药材的总种植面积已从2016年的9.98 万hm2增加到2020年的15.95 万hm2[1],红花(Carthamus tinctoriousL.)作为河南省的道地药材,同时也是一种集药材、油料、染料和饲料为一体的特种经济作物,在河南局部地区种植面积也逐年扩大,因而小麦和红花之间的粮药争地矛盾日渐突出。

间作作为一种集约利用土地的种植方式,通过利用复合群体生态位互补原理,进而实现间作体系高产高效及可持续性,是解决作物争地矛盾的有效途径之一,在国内外受到广泛运用。间作系统作为一种人工复合群体,其效益原理主要是促进光、热、水、养分等资源的高效利用,同时也可以减少作物病虫害的发生[2],这其中主要的生态机制是由于生态位的分离促进了作物间的互补和竞争,从而实现资源利用效率最大化[3],而这种优势的产生与土壤环境的变化密不可分[4],土壤环境的改变会直接影响土壤微生物群落结构和功能。不同栽培方式以及不同作物类型对土壤微生物群落均会产生不同的影响,有研究表明间作可显著提高土壤微生物多样性指数[5-6],与土壤微生物的变化密切相关[7],如Li 等[8]对小麦||黄瓜(Cucumis sativusL.)、黄瓜||三叶草(TrifoliumL.)间作体系中研究表明,间作可明显提高土壤微生物丰富度和多样性。

作物根际是土壤微生物活跃的热点区域,其与微生物群落的组成和作物生长密切相关[9]。根际微生物群落对植物的健康及其生产力至关重要,并且在影响植物生长及其健康方面,根际微生物群落被广泛研究[10]。根际土壤微生物的种类和数量对植物生长发育和健康状况具有重要影响[11-12]。根际微生物种类和数量的变化直接影响土壤养分的吸收和转化[13],有益微生物可通过提高土壤有效养分含量,在促进植物生长的同时提高植物抗逆能力。如丛枝菌根真菌通过与植物建立共生体系,其外部菌丝网络可显著促进宿主对水分和养分的吸收[14]。周贤玉等[15]对玉米(Zea maysL.)||大豆[Glycine max(L.) Merr.]间作研究发现,间作显著提高了丛枝菌根真菌(AMF)对甜玉米根际的侵染率,增强了其对氮磷的吸收,促进作物生长。玉米与不同树木间作后,玉米根系中AM 真菌丰富度显著提高[16]。同样,有害的微生物会对植物的健康生长造成严重威胁,如镰刀菌属(Fusarium)极易引起玉米茎腐病和穗腐病、蚕豆(Vicia fabaL.)的枯萎病等多种土传病害的发生[17]。已有研究表明,玉米||大豆[18]、小麦||蚕豆[19]间作均可显著降低植物根际镰刀菌属的相对丰度。因此,作物多样性种植下土壤微生物多样性及其功能的研究十分重要,已成为近年来土壤地力保护及作物多样性种植生态效应研究的热点问题[20]。

近年来,随着高通量测序技术的发展,对小麦红花根际微生物的研究逐渐增多,研究表明,红花与小麦、玉米等禾本科作物进行轮作换茬,有利于土壤养分平衡,改善根际微生物群落结构,防止红花根腐病的发生[21]。然而,对小麦和红花根际微生物的研究主要集中在品种[22]、种植区域[23-24]及栽培措施[25]的不同所引起的根际微生物群落结构及功能变化,且多采用单作种植模式,小麦红花间作作为一种新型的粮药间作模式,该种植体系下小麦、红花根际微生物群落结构及功能变化尚不十分清楚。因此,本研究采用高通量测序方法研究该间作模式下小麦、红花根际细菌和真菌群落结构及功能变化,以期为构建合理的小麦红花间作模式和地区适宜性评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2020年在河南省新乡市原阳县河南农业大学科教园区(35°7′1″N、113°57′22″E)进行,试验土类型为沙壤土。试验地年均日照时数1945.1 h,年均气温14.7 ℃,年均降雨量623.3 mm,无霜期224 d。耕层基础肥力: 有机质14.26 g·kg-1,全氮0.91 g·kg-1,全磷0.72 g·kg-1,前茬为玉米。

1.2 试验设计

采用大田试验,小麦||红花间作(W||R)采取2∶1的行比种植,以小麦单作(W)和红花单作(R)对照,共计3 个处理。田间小区采用随机区组排列,小区面积为40 m2(长8 m×宽5 m),重复3 次。小麦和红花采用人工播种,二者种植行距均为20 cm,小麦株距0.5 cm 左右,小麦播量为187 kg·hm-2; 红花株距为5 cm,后经过定苗控制在15 cm 左右,种植密度控制在30 万株·hm-2。间作体系内小麦、红花间距同为20 cm。各处理的施肥及田间管理保持一致,采用一次性基施1500 kg·hm-2复合肥(N∶P∶K=1∶1∶1)。供试小麦品种为‘豫农804’,红花品种为‘卫红花1 号’。

1.3 样品采集

分别于小麦、红花成熟期采集植株样品。小麦每个小区采集长势均匀的1 m 双行植株,红花采集同行20 株。根际土壤采集采用“五点取样法”,于小麦拔节期使用酒精消毒过的干净铁锹沿小麦、红花植株外10 cm 周围下挖20 cm,采用抖根法自然抖落覆于植株表面的松散土壤,后用消毒过的毛刷刷取覆于植株根系表面的土,即为根际土[26]。挑取根际土里残留的植物细根,然后将土壤混合均匀后放入无菌自封袋中并贴上标签,封口。每个处理取3 次重复,后将混合均匀的土壤样品置于-80 ℃保存。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 产量、土地当量比及偏土地当量比

对成熟期每个小区采集的1 m 双行小麦植株进行脱粒,并于风干后称重计产; 成熟期采集的20 株红花花蕾全部摘除,脱粒风干后测定20 株红花籽粒总重量,并根据种植密度计算出产量。间作优势采用土地当量比(LER)和偏土地当量比(PLER)来衡量[27]:

式中:Yai和Ybi分别表示间作小麦和红花籽粒产量,Yas和Yas分别表示单作小麦和红花籽粒产量。PLER(a)和PLER(b)分别表示小麦和红花偏土地当量比。LER＞1,表明有间作优势; LER＜1,为间作劣势。

1.4.2 DNA 提取、PCR 扩增和高通量测序

分别取不同处理下的小麦红花根际土壤样品,使用mobio 土壤微生物DNA 强力提取试剂盒PowerSoil®DNA Isolation Kit 提取土壤总DNA,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量,用NanoDrop ND-2000 超微量核酸蛋白测定仪分析抽提DNA 浓度和纯度。选取完整且质量较好的材料用于后续分析,以制备好的DNA 为模板。细菌以16S rRNA (V3+V4)区域引物:(338F: 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3',806R: 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')[28],真菌以ITS 区域(内转录间区)引物: (ITS1F: 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3',ITS2R: 5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')[29],然后通过PCR 扩增、纯化、Solexa PCR、定量、混样、切胶回收等[30],后寄至北京百迈克生物科技有限公司进行高通量测序。

1.5 数据处理与分析

1.5.1 测序数据处理

数据预处理: 主要有如下3 个步骤:

1)质量过滤: 首先使用Trimmomatic v0.33 软件,对测序得到的Raw Reads 进行过滤; 然后使用cutadapt 1.9.1 软件进行引物序列的识别与去除,得到不包含引物序列的Clean Reads。

2)双端序列拼接: 使用Usearch v10 软件,通过overlap 对每个样品的Clean Reads 进行拼接,然后根据不同区域的长度范围对拼接后数据进行长度过滤。

3)去除嵌合体: 使用UCHIME v4.2 软件,鉴定并去除嵌合体序列,得到最终有效数据(Effective Reads)。

使用Usearch 软件[31]对Reads 在97.0%的相似度水平下进行聚类、获得OTU,以SILVA 为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释,可得到每个特征对应的物种分类信息,进而在门和属水平统计各样品群落组成,利用QIIME[32]软件生成不同分类水平上的物种丰度表。

1.5.2 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2020 对产量数据及根际微生物门、属水平数据整理,用IBM SPSS Statistics 25进行数据的方差比较,采用HSD 法进行差异显著性检验(P＜0.05),相关性分析采用 pearson,GraphPad Prism 8 作图。采用百迈客云分析平台对不同处理下OTU 做韦恩图分析,采用R4.1.3 进行物种丰度柱状图绘制、PcoA 分析及可视化、共现网络分析并采用Gephi 0.9.2 对共线网络分析结果进行可视化,采用百迈客云平台进行FARPROTAX 和FUNGuild 细菌真菌功能预测。图片修饰处理采用Adobe Photoshop 2021。

2 结果与分析

2.1 不同种植模式下小麦红花产量及土地当量比

由表1 可知,小麦红花间作作物产量均显著低于相应单作作物产量(P＜0.05)。偏土地当量比作为衡量间作是否具有产量优势的一个重要指标,当偏土地当量比大于间作作物播种面积占比时,说明该作物具有间作产量优势。小麦红花间作体系中,小麦的偏土地当量比大于2/3,红花的偏土地当量比小于1/3,表明小麦红花间作体系内,小麦更具产量优势。此外,小麦红花间作体系内土地当量比为1.01,土地当量比大于1,说明二者具有一定的间作优势,但优势并不明显。

表1 小麦红花间作体系的产量及土地当量比Table 1 Yield and land equivalent ratio of wheat and safflower intercropping system

2.2 小麦红花间作根际细菌真菌群落结构变化

利用MiSeq 平台对采集的样品进行高通量测序,小麦和红花根际土壤细菌和真菌样本的覆盖率均在99%以上(表2)。韦恩图分析结果表明(图1),小麦红花间作对根际土壤真菌群落OTU 总数目及差异OTU 数目的影响大于细菌。间作小麦和单作小麦根际土壤样品分别检测到2161 和2180 个细菌OTU,间作红花和单作红花分别检测到2151 和2157 个细菌OTU。间作小麦和单作小麦处理独有的OUT 数目分别是5 和24,分别占总数目1.10%的0.23%; 而间作红花和单作红花独有的OTU 数目分别为12 和18,分别占总数目的0.56%和0.83%,独有细菌OTU数目普遍较少。间作显著降低了小麦根际细菌OTU 数目; 间作小麦、单作小麦、间作红花、单作红花检测到的根际土壤真菌OTU 的数目分别为442、466、500 和632 个,其中有251 个OTU 是单作小麦与间作小麦共有的,292 个OTU 是单作红花与间作红花共有的,间作小麦、单作小麦、间作红花、单作红花独有的OTU 数目分别是191、215、208 和340,分别占总数目的43.21%、46.14%、41.52%和53.80%,独有的真菌OTU 数目普遍较高(图1),间作降低了红花根际真菌OTU 数目(P＜0.05)。

图1 小麦红花间作根际土壤细菌(a)和真菌(b) OTU 韦恩图分析Fig.1 OTU Venn diagram analysis of rhizosphere soil bacteria (a) and fungui (b) of wheat and safflower intercropping system

表2 小麦红花间作土壤根际细菌和真菌的多样性指数Table 2 Diversity indexes of bacteria and fungi communities in rhizosphere soil of wheat and safflower intercropping system

小麦红花根际土壤细菌多样性指数分析结果(表2)表明,间作均不同程度地提高了小麦和红花根际细菌的Shannon 指数,且在红花根际达到显著水平(P＜0.05),表明间作体系内小麦红花根际土壤细菌多样性大于单作; 而细菌ACE 指数和Chao1 指数在小麦和红花根际均表现为间作低于单作,且在小麦根际达到显著水平(P＜0.05),表明间作降低小麦和红花根际细菌群落的丰富度。小麦红花根际真菌多样性分析结果表明,间作均不同程度地降低了真菌Shannon 指数,且在小麦根际达显著水平(P＜0.05),表明间作降低了小麦和红花根际真菌的多样性。真菌ACE 指数和Chao1 指数在小麦和红花根际明显不同,在小麦根际表现为间作高于单作,在红花根际则表现为间作低于单作,说明间作可提高小麦根际真菌的丰富度,但降低了红花根际真菌的丰富度。

进一步分析间作对小麦红花根际细菌真菌群落均衡的影响,结果(图2)表明,间作显著降低了红花根际真菌和细菌ITS/16S 的比值,说明间作对红花根际细菌和真菌间的均衡性产生了显著影响(P＜0.05)。

图2 小麦红花间作根际土壤微生物群落均衡性分析Fig.2 Equilibrium analysis of rhizosphere soil microbial community of wheat and safflower intercropping system

利用PCoA 分析研究小麦红花根际细菌真菌群落结构,结果表明,红花根际土壤细菌群落在第1 轴上明显分散开来,细菌群落结构的改变主要是由PCoA2 引起,占总方差的18.81%; PCoA1 和PCoA2成分共同解释了55.91%的方差(图3A)。红花根际真菌群落在第2 轴上明显分散开来,说明红花根际真菌群落结构的改变主要是由PCoA1 引起,占总方差的21.57% (图3B); PCoA1 和PCoA2 成分共同解释了38.27%的方差。基于Bray-Curtis 分别对小麦红花根际细菌及真菌PCoA 结果进行置换多元方差分析,结果表明,间作对小麦红花根际细菌群落的影响并不显著(小麦:R2=0.246,P=0.100; 红花:R2=0.396,P=0.1000),但是对小麦红花根际真菌群落产生了显著影响(小麦:R2=0.276,P=0.001; 红花:R2=0.311,P=0.001)。

图3 小麦红花间作根际土壤细菌(A)和真菌(B)群落PCoA 分析Fig.3 PCoA analysis of bacteria (A) and fungi (B) communities in rhizosphere soil of wheat and safflower intercropping system

基于门水平分析小麦红花根际细菌真菌群落组成发现(图4),小麦和红花根际优势细菌门为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes),3 大优势菌门在单作小麦、间作小麦、单作红花和间作红花平均相对丰度总占比分别为71.13%、70.57%、71.40%和70.06%; 间作显著提高了红花根际酸杆菌门、Rokubacteria 的相对丰度(P＜0.05),分别增加6.18%和28.99%,间作对小麦根际各菌门影响并不显著。小麦红花根际优势真菌菌门为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota),优势真菌菌门在单作小麦、间作小麦、单作红花和间作红花平均相对丰度总占比分别为75.99%、80.08.17%、90.50%和69.88%; 间作条件下,根际被孢霉门(Mortierellomycota)显著富集在红花根际(P＜0.05),平均相对丰度占比达14.80%,较单作显著增加436%; 同时,显著降低了红花根际子囊菌门的相对丰度(P＜0.05),降幅达33.66%; 间作对小麦红花根际担子菌门(Basidiomycota)的相对丰度均有不同幅度的提高,分别提高37.09%和45.47%。

进一步从属水平分析小麦红花根际细菌真菌群落组成发现,在属水平对相对丰度排名前20 的菌属进行分析,得到了8 种可明确分类到属水平的菌属(图5)。结果表明,间作小麦根际鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、马赛菌属(Massilia)、Pontibacter、RB41和硝化螺菌属(Nitrospira)的相对丰度较单作小麦分别提高13.07%、23.08%、9.57%、14.83%和5.87%,在Pontibacter属达显著水平(P＜0.05)。与小麦不同,间作红花较单作红花在鞘脂单胞菌属、Pontibacter属的相对丰度分别显著降低21.79%、33.61% (P＜0.05),但MND1属的相对丰度显著提高24.37% (P＜0.05)。对相对丰度排名前10 的真菌菌属分析结果表明,与单作小麦相比,间作小麦在被孢霉属(Mortierella)、镰刀菌属(Fusarium)、Wickerhamomyces、枝孢霉属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus)的相对丰度分别降低36.10%、40.96%、47.17%、11.13%和19.94%,Filobasidium属的相对丰度显著提高99.07% (P＜0.05)。与单作红花相比,间作红花在镰刀菌属和链格孢属(Alternaria)的相对丰度显著降低77.42%和66.28% (P＜0.05),被孢霉属、Wickerhamomyces和Filobasidium属的相对丰度显著提高454.00%、716.00%和75.00% (P＜0.05)。

图5 小麦红花间作根际土壤细菌(A)和真菌(B)属的丰富度Fig.5 Abundance of bacteria (A) and fungal (B) genus in the rhizosphere soil of wheat and safflower intercropping system

2.3 小麦红花间作对根际土壤细菌真菌群落功能的影响

使用FARPROTAX 预测得到小麦和红花根际土壤细菌功能注释结果(表3): 注释到参与好氧氨氧化、硝化作用、发酵、硝酸盐还原过程的细菌总相对丰度占比表现为红花间作显著高于单作,相对丰度总占比分别提高14.99%、10.49%、37.31%和25.72%;然而,注释到参与到好氧化能异氧和化能异氧过程细菌总相对丰度占比表现为红花间作显著低于单作,相对丰度总占比分别为19.18%和6.58% (P＜0.05)。但间作对小麦根际细菌群落功能并未产生显著影响。综上,小麦红花间作可能对红花根际土壤养分循环过程产生重要影响。

表3 小麦红花间作根际细菌FARPROTAX 功能预测Table 3 Bacterial FARPROTAX function prediction in the rhizosphere soil of wheat and safflower intercropping system%

真菌FUNGuild 数据库注释结果(表4)显示: 在红花根际,注释到的丛枝菌根菌类真菌相对丰度总占比表现为红花间作显著高于单作,增幅高达197%;相反,注释到的内生真菌和寄生真菌类真菌的相对丰度总占比表现为红花间作显著低于单作,分别降低78.18%和67.66% (P＜0.05); 此外,注释到的植物腐生生物和植物病原菌真菌的相对丰度总占比分别降低46.27%和38.90%。在小麦根际,注释到的土壤腐生生物类真菌的相对丰度总占比表现为小麦间作显著低于单作,降低99%,但对其余类别未造成显著影响。综上,小麦红花间作可有效降低红花根际土壤中有害真菌如植物病原菌类真菌的相对丰度,增加有益真菌如丛枝菌根类真菌的相对丰度。

表4 小麦红花间作根际土壤真菌FUNGuild 功能预测Table 4 Fungi FUNGuild function prediction in the rhizosphere soil of wheat and safflower intercropping system%

2.4 细菌真菌多样性及功能对小麦红花产量的潜在影响

将细菌多样性和功能与产量进行Pearson 相关性分析(图6A),结果发现,Shannon 多样性指数与产量呈显著负相关,产量与化能异氧和尿素溶解过程相关基因丰度呈显著正相关,与好氧亚硝酸盐氧化、好氧氨氧化、硝化作用等过程显著负相关(P＜0.05),说明根际土壤细菌的潜在功能可能对产量产生了重要影响。具体分析根际土壤优势细菌属与功能基因丰度的关系(图6C),结果发现,马赛菌属、Pontibacter与尿素溶解、化能异氧等养分循环过程显著正相关(P＜0.05),与好氧氨氧化、硝化作用呈显著负相关(P＜0.05),MND1与尿素溶解、化能异氧过程呈显著负相关,与好氧氨氧化、硝化作用呈显著正相关(P＜0.05),此外,RB41、硝化螺菌属与尿素溶解过程呈显著负相关(P＜0.05)。可见,在优势细菌属中,马赛菌属、Pontibacter、MND1、RB41、硝化螺菌属是发挥根际微生物群落功能的重要成员。

真菌多样性及功能与产量相关分析结果表明(图6B),产量与植物病原菌功能基因丰度显著负相关(P＜0.05),具体分析真菌优势菌属与功能基因丰度的关系发现(图6D),镰刀菌属(Fusarium)与植物病原菌功能基因丰度显著正相关,Filobasidium、Vishniacozyma与之呈显著负相关(P＜0.05)。可见,镰刀菌属或许是引起植物病原菌功能基因丰度变化的优势真菌属。

图6 小麦红花间作根际土壤细菌(A,C)真菌(B,D)多样性及功能与产量及优势菌属相对丰度的相关性Fig.6 Pearson correlations of diversity,function and yield of bacteria (A,C) and fungi (B,D) with relative abundance of dominant genera in the rhizosphere soil of wheat and safflower intercropping system

2.5 小麦红花根际土壤细菌真菌共现网络分析

大多数基于微生物的高通量数据的分析方法只关注所研究群落的单一属性,很少关注微生物物种之间的相互作用,共现网络分析被广泛用于探索复杂微生物群落中微生物分类单元之间的相互作用,本研究在属水平分别选取不同处理下小麦红花根际细菌真菌相对丰度排名前50 的菌属,利用共现网络图比较不同处理下细菌和真菌群落的共生关系和群落复杂性(图7)。不同处理下微生物群落的拓扑网络性质如表5 所示,与单作小麦相比,间作小麦增加微生物网络的总边缘数,红花则相反,说明间作可一定程度上提高小麦根际微生物网络的复杂性,降低红花根际微生物网络的复杂性。与单作相比,间作小麦和间作红花均增加了负相关边在总边中所占的比例,降低了正相关边所占的比例。在图密度和模块性指数上,间作小麦较单作小麦均有明显提高,红花则相反。值得注意的是,单作红花根际镰刀菌属位于网络的中心,且数量明显多于间作,说明在单作体系下镰刀菌属与其他菌属间的关系更为密切,间作可能通过影响微生物间的相互作用进而减少红花根际镰刀菌属的数量。

表5 小麦红花间作根际土壤微生物群落共现网络拓扑性质Table 5 Co-occurrence network topological properties of soil microbial communities

图7 小麦红花间作根际土壤微生物群落共现网络分析Fig.7 Co-occurrence network analysis of soil microbial communities in the rhizosphere soil of wheat and safflower intercropping system

3 讨论与结论

间作制度在农学、生态学、植物生理学均具有重要意义,总的来说,合理的间作制度可改变土壤微生物多样性[33],减少发病率,提高作物产量[34]。为了更好地缓解河南局部地区存在的粮药争地矛盾,保证粮食安全的同时,稳步发展具有地区特色优势的中草药材,本研究选用在河南极具种植优势的中草药材红花同广泛种植的小麦间作,探究小麦红花间作体系的生产力及对根际微生物群落结构的影响。研究结果表明,小麦红花间作土地当量比接近于1,并没有显现出明显的间作优势,具体表现为间作提高了小麦产量,显著降低了红花的产量,具体原因可能是小麦根系属于须根系,具有庞大的侧根结构,在养分等资源竞争上处于优势地位,而红花根系属于直根系,侧根短而细,加上行距同普通小麦行距,因而在养分竞争上处于弱势地位,进而引起了后期产量上的差异。

土壤微生物多样性与土壤生态系统稳定性和养分转化密切相关[35],大量研究表明,作物间作不仅能增加地上部生物多样性,还能对地下土壤微生物多样性和组成起到调节作用[36]。土壤微生物多样性指数和丰富度指数是表征群落多样性的常用指数,常常用来揭示土壤微生物种类以及功能的差异[37]。本研究结果表明,间作提高了小麦红花根际细菌多样性,降低了真菌的多样性,在丰富度上,间作条件下除间作小麦根际真菌丰富度明显提高外,在细菌以及红花根际细菌真菌丰富度均有不同程度下降。与之类似,吴加香等[38]在黄草乌(Aconitum vilmorinianumKom.)间作玉米研究中表明,黄草乌间作玉米同样提高了黄草乌根际微生物多样性,同时也显著提高了黄草乌根际真菌群落的丰富度。其与董艳等[39]报道的蚕豆小麦间作提高蚕豆、小麦根际微生物的丰富度指数与多样性指数的研究结果类似。除此之外,Wang 等[40]在小麦间作芸薹属(Brassica)植物的研究中也得出了与本研究结果类似的结论。间作可以影响其根际土壤微生物群落的多样性,该结果也与大多数的作物间作能提高根际微生物的多样性的研究结果相同[41]。这表明间作可使土壤微生物群落多样化,其原因可能是由于不同的植物种类对土壤微生物群落产生了影响[42],间作系统中不同作物会产生不同的特异根系分泌物,并形成与之相适应的特异的根际微生物群落,复杂的微生物群落可能提高土壤微生物的整体代谢活性,促进土壤微生物群落结构多样化的形成[43]。此外,为进一步了解间作对小麦红花根际微生物群落结构的影响,分别对小麦红花根际细菌及真菌群落进行均衡性分析发现,间作显著降低了红花根际真菌和细菌的OTU 比值(图2),说明间作对红花根际真菌与细菌均衡性产生了显著影响,同时,PCoA 分析结果表明间作显著影响了红花根际真菌群落结构(P＜0.05),这说明细菌与真菌群落的均衡性可能受到种植方式的影响,但考虑到根际微生物类群复杂多样,微生物间存在复杂的相互作用,具体是哪种原因导致红花根际微生物群落结构的改变还需做进一步验证。

为了进一步揭示微生物群落的潜在功能,通过FAPROTAX 和FUNGuild 分别对小麦和红花根际细菌和真菌进行功能预测。细菌预测结果表明,间作显著提高了红花根际的好氧氨氧化、硝化作用、硝酸盐还原等过程,可见,间作对红花根际养分循环具有显著的影响,结合细菌优势菌属与功能预测相关性分析结果发现(图6C),细菌MND1属与尿素溶解、硝化作用、硝酸盐还原、发酵化能自养等功能具有显著相关性,结合属水平(图5A)细菌相对丰度结果发现,MND1属的相对丰度在红花根际表现出间作显著高于单作,MND1属是亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)的一属,亚硝化单胞菌科是参与硝化作用的一类重要微生物类群,可见,MND1属是引起根际养分循环过程的重要菌属,因此,间作红花可能是改变了根际MND1等参与养分循环过程相关菌属丰度,进而调控红花根际养分循环过程,提高养分的有效性,从而缓解间作体系内红花对养分竞争的不利地位。进一步对真菌功能进行预测发现,同样间作对红花根际真菌功能也产生了显著影响,间作显著提高了红花根际丛枝菌根类真菌的相对丰度(表4),丛枝菌根在促进植物生长发育、改善宿主对养分的吸收利用上发挥着重要作用,结合优势真菌属与功能预测结果发现,曲霉属、枝孢霉属、管柄囊霉属与丛枝菌根功能基因相对丰度显著正相关(图6D),其相对丰度在红花根际均表现为间作高于单作,此外,被孢霉属作为根际有益微生物,其相对丰度在红花间作体系中也明显高于单作体系(图5B),可见,处于竞争劣势的红花也可调动优势真菌菌属相对丰度以适应其在养分竞争上的不利地位,有益微生物的增加不仅能够促进植物生长,而且可以提高植物的抵抗力水平,促生机制主要表现为使植物获得水分、无机盐等营养物质的能力提高[44]。此外,功能预测结果发现,间作显著降低了红花根际植物病原菌类真菌的总相对丰度,有趣的是,在相关性分析结果中发现(图6D),致病菌属镰刀菌属与植物病原菌呈显著正相关,且间作显著降低了红花根际镰刀菌属的相对丰度(图5B)。此外,从共现网络图中(图7C,D)也可明显看出镰刀菌属在间作红花中的比例明显低于单作,并且在单作红花中镰刀菌属位于网络的中心,与其他菌属间的关系密切。研究表明,为了维持整个系统的稳定性,土壤微生物群落中致病微生物越多,要求微生物之间的关系越复杂[45]。从共现网络的总边数也可以看出,单作红花较间作更为复杂,说明小麦/红花间作可在一定程度上减少红花根际病原菌的数量。与本研究结果类似,代真林等[18]在玉米大豆间作体系中研究得出间作处理下玉米根际镰刀菌属的相对丰度低于单作。此外,间作也显著降低了红花根际链格孢属的相对丰度(图5B),链格孢属同样是引起植物病害的重要真菌类群之一。可见,小麦红花间作体系可在一定程度上提高红花根际有益真菌的相对丰度,降低有害病原真菌的相对丰度,然而,其对更多功能性真菌的影响还有待进一步研究。

综上,小麦红花2∶1 间作模式并没有展现出明显的间作优势,但间作明显提高了小麦红花根际细菌多样性,处于竞争劣势的红花可通过优化根际微生物群落结构,改善微生物群落组成,从而改善根际养分循环过程,提高养分利用效率。此外,间作可显著降低红花根际镰刀菌属、链格孢属等致病菌的相对丰度,对防治红花根腐病、黑斑病均具有重要生态学意义。然而,由于根际土壤微生物的复杂性,许多微生物的功能尚未明了,因此,今后可以结合土壤理化性质,通过宏基因组测序进一步分析小麦红花间作条件下根际土壤微生物的功能,进而了解小麦红花间作体系的生产和生态效益,并结合地上部植株生长发育状况,适当增加间作组合,以期构建合理的适宜推广的小麦红花间作模式。