贵州烟草棒孢霉叶斑病生防菌鉴定及防治药剂筛选

潘忠梅, 曹 毅, 桑维钧, 孙光军,何世芳, 陆 宁, 陈兴江, 梅锦明

(1.贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081；2.贵州省烟草公司施秉县分公司，贵州 施秉 556299；3.贵州大学 烟草学院，贵阳 550025；4.中国烟草总公司贵州省公司，贵阳 550004；5.贵州省黔之研科技服务有限公司，贵阳 550008)

多主棒孢菌Corynespora cassiicola属于真菌门暗色菌科棒孢属病原真菌[1]，可侵染橡胶[2]、木薯[3]、黄瓜[4]、木槿[5]、莲藕[6]、草莓[7]、苎麻[8]、生菜[9]和烟草[10]等多种植物。2000 年我国首次报道其侵染烟草叶片[11]，受侵染叶片初产生暗绿色小点，后发展为带有黄色晕圈的褐色小斑点，斑点呈圆形或不规则形，密集的小斑最终可联合为不规则形的褐色大病斑[12]。近年来，烟草棒孢霉叶斑病在贵州分布范围和危害呈扩大和上升趋势，因此筛选出对其防治有效的药剂至关重要。梁贵林等[13]曾于2008 年在贵州针对代森锰锌等9 种商品化杀菌剂对烟草棒孢霉叶斑病的田间防治效果进行了筛选，结果认为80%代森锰锌悬浮剂的防治效果较好，但由于时间久远，病原菌可能对以往药剂产生了一定的抗药性。据中国农药信息网[14]统计，截至2022 年7 月19 日登记有305个烟草用杀菌剂产品，但尚未见针对烟草棒孢霉叶斑病登记使用的杀菌剂。近年来，生物防治由于具有安全、高效、环保等特性而逐渐受到关注[15-16]。在烟草上，陆续有研究者筛选出可有效防治黑胫病[17]、青枯病[18]、赤星病[19]和炭疽病[20]等病害的生防菌株。为筛选出高效的用于防治烟草棒孢霉叶斑病的生防菌株和杀菌剂，本实验室在前期工作中筛选得到了对烟草棒孢霉叶斑病菌具有较强抑制效果的生防菌株YC2140。本研究对该菌株进行了鉴定，并选取了5 种不同作用机制的杀菌剂与YC2140 菌株一起展开盆栽与田间防效试验，以期为烟草棒孢霉叶斑病的科学防治及药剂筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与地点

供试菌株：烟草多主棒孢菌株Corynespora cassiicolaYC1104，来源遵义，登录号为MW686731；生防菌株YC2140，实验室前期筛选所得。

供试培养基：Biolog 通用生长琼脂培养基(BUG)[21]。

供试杀菌剂：70% 代森锰锌可湿性粉剂(mancozeb 70% WP) 和50%啶酰菌胺水分散粒剂(boscalid 50% WG)，巴斯夫植物保护(江苏)有限公司；500 g/L 氟啶胺悬浮剂 (fluazinam 500 g/L SC)，宁波石原金牛农业科技有限公司；430 g/L戊唑醇悬浮剂 (tebuconazole 430 g/L SC)，拜耳作物科学(中国)有限公司；450 g/L 咪鲜胺水乳剂(prochloraz 450 g/L EW)，苏州富美实植物保护剂有限公司。上述药剂均购自市场。

供试烟草品种：K326。

试验时间与地点：盆栽试验，于2020 年9 月至2020 年10 月在贵州省烟草科学研究院人工气候室进行；田间试验，于2021 年7 月在贵州省烟草科学研究院福泉基地进行。均于烟株打顶后7 d开始施药。

1.2 生防菌株鉴定

1.2.1 生防菌株Biolog 鉴定 采用Biolog 全自动微生物鉴定系统GEN Ⅲ 微孔板对筛选出的生防菌株YC2140 进行鉴定[21]。菌株在Biolog 推荐的BUG 培养基上于30 ℃ 培养24 h。先将菌株细胞浓度调至95%T(T 为Biolog 浊度仪所测得的透光率)，再将菌悬液倒入V 型加样槽中，用8 通道电动移液器按每孔100 μL 的量将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中，于30 ℃ 黑暗培养24 h 后用MicroLog 读数仪读板，读数结果直接与数据库进行比较获得鉴定结果。

1.2.2 生防菌株16S rRNA 和gyrB 序列分子鉴定

对筛选出的菌株采用微生物裂解液法提取DNA，采用引物27F/1492R 和UP-1/ UP-2r (上海捷瑞生物工程有限公司合成) (表1) 分别对病原菌16S rRNA 和gyrB 基因序列进行 PCR 扩增。16S rRNA 序列反应体系为 50 μL：PCR Premix 25 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 18 μL。反应程序为：94 ℃ 预变性10 min；95 ℃ 变性30 s，56 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸90 s，35 个循环；最后72 ℃ 延伸10 min。gyrB 序列反应体系为 25 μL：PCR Premix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物 0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。反应程序为：94 ℃ 预变性2 min；94 ℃ 变性1 min，60 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸2 min，30 个循环；最后72 ℃ 延伸10 min。PCR 扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳进行检测。电泳检测合格的PCR 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，序列在NCBI (National Center for Biotechnology Information)官网上进行BLAST 比对分析，同时将序列提交至GenBank 获取登录号。下载相似性在99% 以上的基因序列，利用MEGA X 软件NJ (Neighbor-Joining)法构建系统发育树。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 盆栽试验

试验设500 g/L 氟啶胺悬浮剂、430 g/L 戊唑醇悬浮剂、450 g/L 咪鲜胺水乳剂、50%啶酰菌胺水分散粒剂和1 × 108cfu/mL YC2140 发酵液5 个药剂处理，以清水处理为对照，施药剂量见表2。每处理1 株烟，每株烟3 片中下部叶。采用叶面喷雾施药3 次，施药间隔期为7 d。于施药后24 h将直径6 mm 的烟草多主棒孢菌饼接种于叶片上，每叶接种6 块菌饼，在25～28 ℃、相对湿度80%下培养。分别于施药后7、14 和21d 调查，按 (1) 和 (2) 式分别计算病情指数 (Di) 和防治效果 (E)。

表2 盆栽试验及田间试验施药剂量Table 2 Dosage of fungicides for pot test and field trial

式中，Ni为各级病叶数；i为相应的级数值；Nt为调查总叶数；Dic为对照区病情指数；Dit为处理区病情指数。

病级分级标准依据GB/T 23222[24]执行，0 级：全叶无病；1 级：病斑面积占叶片面积的1%以下；3 级：病斑面积占叶片面积的2%～5%；5 级：病斑面积占叶片面积的6%～10%；7 级：病斑面积占叶片面积的11%～20%；9 级：病斑面积占叶片面积的21%以上。

1.4 田间试验

试验设500 g/L 氟啶胺悬浮剂、430 g/L 戊唑醇悬浮剂、70%代森锰锌可湿性粉剂、450 g/L 咪鲜胺水乳剂和1 × 108cfu/mL YC2140 发酵液5 个药剂处理，以清水处理为对照，每处理3 次重复，共18 个小区，每小区30 株烟，采用随机区组排列，周边设有保护行。施药剂量见表2。在烟株打顶后7 d 采用叶面喷雾施药2 次，施药间隔期为7 d。分别于施药前 (0 d) 及药后7 d 和14 d，按五点取样法每点调查0.6 m2[25]。分别按 (1) 和 (2)式计算病情指数和防治效果。

盆栽试验和田间试验的生产管理方式一致，均施用烟草专用复合肥，采用生产上配套的施肥和管理技术。

1.5 数据分析

利用 SPSS 26.0 软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 生防菌株鉴定

生防菌株YC2140 培养24 h 后经Biolog 鉴定，结果为Pseudomonas fluorescens，相似度(SIM)为0.55，距离(DIST)为6.71 (表3)。将16S rRNA 基因序列与GenBank 数据库中同源序列比对分析得出，YC2140 菌株基因序列长度为1360 bp，与Pseudomonassp.相似性达100%。进一步gyrB 基因序列分析得出，YC2140 菌株基因序列长度为1171 bp，与Pseudomonas fluorescens相似性达99%以上，系统发育树分析中，YC2140 菌株与Pseudomonas fluorescens聚为一支(图1)。最终将YC2140 菌株鉴定为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens，序列提交至GenBank 后获取登录号为OM273379(16S rRNA)和ON109871 (gyrB)。

表3 YC2140 Biolog 鉴定结果Table 3 Biolog identification results of YC2140 strain

图1 产生于gyrB 基因序列的系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree based on gene gyrB

2.2 盆栽试验结果

4 种供试杀菌剂及生防菌YC2140 在推荐剂量下对烟草棒孢霉叶斑病的盆栽防治效果见表4。可见：药后7 d，500 g/L 氟啶胺悬浮剂和450 g/L 咪鲜胺水乳剂的防治效果较好，均在40%以上；其次是430 g/L 戊唑醇悬浮剂，防治效果为38.61%；1 × 108cfu/mL YC2140 发酵液无防治效果；而50% 啶酰菌胺水分散粒剂则呈现出负的防治效果。药后14 d 和21 d，500 g/L 氟啶胺悬浮剂和450 g/L 咪鲜胺水乳剂防治效果较好，均在70%以上；其次为430 g/L 戊唑醇悬浮剂，防治效果分别为39.75%和67.12%；YC2140 发酵液的防治效果分别为29.71%和61.64%；防治效果最差的为50%啶酰菌胺水分散粒剂。

2.3 田间试验结果

试验结果 (表5) 表明：在各药剂推荐剂量下，450 g/L 咪鲜胺水乳剂对烟草棒孢霉叶斑病的防治效果最好，药后7 d 和14 d 的防治效果分别为48.71%和43.33%；其次是500 g/L 氟啶胺悬浮剂和430 g/L 戊唑醇悬浮剂；YC2140 发酵液的防治效果较差；防治效果最差的为70%代森锰锌可湿性粉剂。

表5 杀菌剂及生防菌对烟草棒孢霉叶斑病田间防治效果Table 5 Control efficacy of fungicides and biocontrol strains on tobacco Corynespora leaf spot in field experiment

3 结论与讨论

本研究对实验室前期工作中筛选所得的对烟草多主棒孢菌具有明显抑制作用的生防菌株YC2140 进行了鉴定，经Biolog 鉴定分析、16S rRNA 基因序列、gyrB 基因序列以及系统发育树分析，鉴定其为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens。荧光假单胞菌可以通过产生抗生素、水解酶和诱导系统抗性，提高植物抗病性[26]，且荧光假单胞菌分布广泛，施用方便，能有效抑制多种病原微生物，在烟草上的研究和应用也逐渐增多[27]，已成为具有应用价值的一类生防菌和根际促生菌[28]。

1 × 108cfu/mL YC2140 发酵液和4 种供试杀菌剂的盆栽试验结果表明：药后21 d，供试的500 g/L 氟啶胺悬浮剂和450 g/L 咪鲜胺水乳剂对烟草棒孢霉叶斑病的防治效果较好，均在70%以上，且好于药后7 d，分析原因为室内影响因素较好控制，药剂的作用得到较好的发挥。药后7 d，YC2140 发酵液对烟草棒孢霉叶斑病无防治效果，但21 d 后其防治效果达61.64%，可能是因为生防菌株从施用到定殖于烟叶上并发挥杀菌作用需要一定的时间[29]。相对于荧光假单胞菌防治其他病害，YC2140 菌株对烟草棒孢霉叶斑病的盆栽防效为中上等水平。有研究表明，荧光假单胞菌SN15-2 对番茄青枯病盆栽防效为46.58%[30]，荧光假单胞菌对黄瓜枯萎病和烟草花叶病毒病的盆栽防效分别为75.0%和59.2%[31-32]。本研究中，药后7 d，50%啶酰菌胺水分散粒剂的防治效果为负数，但21d 时防治效果升到46.12%，可能是因为其药效发挥较慢。

选择盆栽试验中防治效果较好的500 g/L 氟啶胺悬浮剂、450 g/L 咪鲜胺水乳剂、430 g/L 戊唑醇悬浮剂和1 × 108cfu/mL YC2140 发酵液，以及生产上常用的药剂70%代森锰锌可湿性粉剂进行田间防效试验。结果表明，450 g/L 咪鲜胺水乳剂和500 g/L 氟啶胺悬浮剂的防治效果最好，其次是430 g/L 戊唑醇悬浮剂，然后是YC2140 发酵液，最后是70%代森锰锌可湿性粉剂。2008 年梁贵林等[13]推荐生产上防治烟草棒孢霉叶斑病的主要用药为50%代森锰锌可湿性粉剂，但在本研究中70%代森锰锌可湿性粉剂防治效果最低，推测病原菌对代森锰锌可能产生了抗药性。本研究表明，在未发现更好的防治烟草棒孢霉叶斑病的杀菌剂之前，可考虑交替使用咪唑类杀菌剂和线粒体氧化磷酸化解偶联剂氟啶胺。

贵州烟草棒孢霉叶斑病在6 月下旬前病害发展缓慢，但在6 月底至7 月上中旬的较高温季节，若遇连续阴雨天气且菌源量较大时，病害发展迅速[33]。本研究中，田间试验的防治效果均明显低于盆栽试验，可能是田间环境复杂因素影响大，如施药后下雨等，可使得药效降低，尤其对于生防菌，其有效成分为生物活体，被雨水稀释后较难定殖于烟叶上[34]；也可能是因为施药前烟叶发病比较严重，施药后药效发挥作用受限。田间试验时是在烟草发病后使用的杀菌剂，部分保护性药剂和生防菌YC2140 药效明显较低。本研究结果可为贵州烟草棒孢霉叶斑病的防治药剂筛选提供理论依据。