猫杯状病毒抗原检测胶体金试纸条的研制

李华斌,田崇瑜,李欣昱,李春和,张 然,杨峰清,刘 媛,贺 威,谭凌云,赵忠鹏*,闫 芳* (.山西农业大学 动物医学学院,山西 晋中 030800;.安徽医科大学 基础医学院,安徽 合肥 3003;3.北京希牧生物技术有限公司,北京 0076;4.内蒙古华希生物科技有限公司,内蒙古 呼和浩特 00)

猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)又名猫传染性鼻-结膜炎病毒,可引起猫的上呼吸道感染、慢性肠胃炎以及口腔溃疡等疾病,称为猫传染性鼻-结膜炎。该病发病率极高并呈世界性分布,极易感染1岁内的幼猫,导致幼猫死亡[1-3]。其临床症状复杂,并且FCV常常与其他病毒或寄生虫混合感染,增加了 FCV的临床检测难度,急需建立一种快速、准确、简单的诊断 FCV 的方法。而胶体金检测技术(colloidal gold test)具有简便、灵敏、特异、快速等特点,而且可以快速检测大量样品,在医学及动物学检疫、检验中已被广泛应用。本试验利用从临床分离的FCV进行培养、纯化、浓缩,以纯化浓缩的FCV为抗原制备了抗FCV单克隆抗体和多克隆抗体,结合胶体金免疫层析技术制备了快速检测FCV抗原的胶体金诊断试纸条,为FCV的特异性诊断和流行病学调查提供了一种快速、有效的检测工具,也为开发成品化检测试纸条奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒、标准抗原与实验动物猫肾细胞(F81)、SP2/0骨髓瘤细胞由本实验室保存;FCV毒株、猫细小病毒(feline panleukopenia virus,FPV)毒株、猫疱疹病毒(feline herpesvirus,FHP)毒株、猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,FIP)毒株由吉林农业大学动物科技学院提供;BALB/c小鼠(6～8周龄和10周龄以上,分别用于免疫和腹水制备)购自山西医科大学小动物研究室,体质量2.0～2.5 kg家兔,购自山西农业大学动物科学学院兔场。

1.2 试剂HAT、HT选择培养基、PEG、苯基琼脂糖凝胶6FF柱(phenyl sepharose 6 fast flow)、DEAE 阴离子交换柱,HPR标记的羊抗鼠IgG、mouse monoclonal antibody isotyping kit均为Sigma公司产品;氯金酸(HAuCl4·H2O)为上海生物工程技术服务有限公司产品;BSA为Promega公司产品;硝酸纤维膜(HF13502S20)购于Millipore公司;玻璃纤维纸(SN80)购自上海金标科技有限公司产品;RPMI1640培养基等均为GIBCO公司产品。

1.3 抗原的制备大量培养FCV分离株,以5 000 r/min离心30 min,上清以4.0 mL/min的速度依次经过0.65 μm的滤膜和超滤浓缩管浓缩过滤,去除较大分子杂蛋白和小分子杂蛋白,最后将10 L样本超滤浓缩至500 mL。将样品用透析袋浓缩至150 mL。将浓缩后的样本经苯基琼脂糖凝胶6FF柱(phenyl sepharose 6 fast flow)、DEAE 阴离子交换柱收获含病毒的蛋白峰,分别收集不同蛋白峰,将不同蛋白峰透析完全后再经PEG6000,进行浓缩。将浓缩好的蛋白峰进行超速离心,31 000 r/min,4℃离心3 h,弃去上清,沉淀用3 mL PBS重悬,存于-80℃待用。纯化产物进行TCID50测定、通过SDS-PAGE检测纯度,用BCA法测定蛋白浓度。

1.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选将超浓缩纯化的FCV与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠,皮下免疫3次,间隔2周,免疫剂量为16 μg/只。最后一次免疫后第7天,测定中和效价。选择效价高的小鼠,在融合前3 d,尾静脉注射不加佐剂的抗原进行加强免疫。3 d后进行细胞融合,取免疫小鼠的脾细胞与对数生长SP2/0骨髓瘤细胞在PEG(MW4000)的作用下融合。间接 ELISA法筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞株,对阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养。

1.5 单克隆抗体的制备鉴定及纯化

1.5.1单克隆抗体特异性鉴定 以纯化的FCV病毒株作为抗原,取经Western blot进行免疫印迹,检测每株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的抗原特异性。

1.5.2单克隆抗体的制备 复苏杂交瘤细胞进行传代培养,挑选状态良好细胞用1640培养基稀释至1×106/mL,注入BALB/c母鼠腹腔,1 mL/只。15 d后收集腹水,4 000 r/min离心10 min收集上清,-20℃保存。

1.5.3单克隆抗体效价的测定 将5种腹水进行10倍比稀释,用间接ELISA方法测定其效价,设空白小鼠腹水为阴性对照。

1.5.4单克隆抗体的中和活性鉴定 将200 TCID50的FCV与1∶10稀释好的单抗1∶1混匀,置于37℃孵育45 min后,加至96孔细胞培养板中,24 h后判定结果。用固定病毒-稀释血清的方法,将制备的腹水1∶10稀释后,再进行2倍比稀释,检测中和抗体效价。

1.5.5单克隆抗体的纯化 采用protein G 亲和层析纯化抗体,纯化后用10 mmol/L PBS透析,分光光度计280 nm测定蛋白浓度并分装冻存。

1.6 兔抗FCV多克隆抗体的制备及纯化免疫5次,第1次用完全弗氏佐剂与等量纯化的FCV毒株混匀,第2、3、4次用不完全弗氏佐剂与等量纯化的FCV毒株混匀。前4次免疫时间各间隔7 d,背、颈部皮下多点注射,第5次为加强免疫,耳静脉注射,免疫后第4天麻醉家兔后颈动脉采血,分离血清,用 4℃预冷的0.01 mol/L pH7.2的 PBS 4倍稀释血清,硫酸铵沉淀法沉淀蛋白,再用protein G 柱亲和纯化,用0.01 mol/L pH7.2的PBS进行透析,离心后测定ELISA抗体效价及蛋白含量,放于-20℃冰箱中保存备用。

1.7 免疫胶体金检测试纸条的制备

1.7.1胶体金制备 采用柠檬酸三钠还原法制备20 nm胶体金[4],配制100 mL 的0.01% HAuC14水溶液,加热煮沸,加入1.0 mL的1%柠檬酸三钠水溶液,煮沸15 min,待颜色稳定为酒红色后冷却至室温,加蒸馏水至100 mL,置于2～8℃保存。

1.7.2胶体金与抗体的标记 参照文献[5-6]的方法。量取胶体金溶液1 mL,用0.2 mol/L K2CO3调整胶体金溶液的pH值为7.5,选取0.03 mg兔抗FCV多克隆抗体加入胶体金溶液中并继续搅拌30 min,再加入100 μL 20%的BSA,搅拌5 min,加入PEG20000 100 μL反应30 min,10 000 r/min离心10 min,弃上清,100μL重悬沉淀即为金标多克隆抗体,4℃备用。

1.7.3金标多抗工作浓度的确定 将玻璃纤维膜先于Tris-HCL缓冲液中漂洗,去除表面杂质,37℃真空干燥30 min,Tris-HCL缓冲液稀释金标单抗1∶0,1∶1,1∶2,1∶3充分混匀,喷于玻璃纤维膜上,吸附1 h,37℃真空干燥30 min,通过检测FCV细胞培养毒,确定金标单抗最佳工作浓度。

1.7.4检测抗体和质控抗体最佳工作浓度的确定 用 0.01 mol/L pH7.6 的 PBS 分别将纯化的抗FCV单克隆抗体和羊抗兔二抗稀释为以下质量浓度:0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.0 g/L,喷涂于硝酸纤维素膜(NC)上,形成间距为 0.5 cm的检测线和对照线,置室温自然干燥。通过检测FCV细胞培养毒,观察显色情况,确定两者最佳工作浓度。

1.7.5胶体金免疫层析试纸条的组装 首先将NC 膜(14 mm)固定到PVC 底板上, NC膜检测线一侧为金标垫(8 mm)和样品垫(20 mm),质控线一侧为吸水纸(32 mm),组装时彼此重叠2 mm,用切纸机将组装的试纸板切成 4 mm 宽的试纸条,组装于试纸条卡壳即为成品。

1.8 胶体金试纸条性能测试

1.8.1特异性试验 对FCV毒株、猫细小病毒毒株、猫疱疹病毒毒株及猫传染性腹膜炎病毒毒株进行检测,确定试纸条特异性。

1.8.2灵敏性试验 将107.5TCID50/mL的FCV细胞培养毒进行1∶100～ 1∶12 800系列稀释,用制备的试纸条进行检测,以评价试纸条的敏感性。

1.8.3稳定性检测 分别用保存3,6,9,12,15个月(4℃保存)的试纸条检测FCV阳性样品,以检测试纸条的稳定性。

1.8.4胶体金试纸条样品处理条件优化 分别用PBS和公司购买的病毒采样管处理实验室培养的FCV病毒样品和采集的20份临床样品,利用自制的FCV胶体金试纸条对进行检测,以评价胶体金试纸条对样品处理的要求。

1.8.5胶体金诊断试纸条的初步应用 分别用制备的胶体金试纸条与RT-PCR方法同时对76份猫鼻咽拭子进行检测,比较两者的符合率。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞的制备小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,经间接ELISA检测、筛选获得了5 株稳定分泌抗FCV 毒株抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E2、4C3、5F11、6G9和7D2。

2.2 单克隆抗体的Western blot鉴定Western blot结果显示5株单均可识别FCV病毒株,表明均为FCV特异性抗体(图1)。

1.1E2;2.4C3;3.5F11;4.6G9;5.7D2

2.3 单克隆抗体腹水效价测定经间接 ELISA 方法对获得5株单抗的腹水进行效价测定,结果1E2和6G9的腹水效价为1∶6 400;4C3、5F11和7D2的腹水效价为1∶12 800。其中4C3和5F11有中和活性,其中和效价分别为1∶640和 1∶320。

2.4 胶体金试纸条工作条件的确定金标抗体1∶2(约0.1 g/L)铺于玻璃纤维膜, T、C 线抗体质量浓度分别以1.0,0.5 g/L喷线组装的试纸条,检测FCV细胞培养毒,T、C 线均有较清晰显色,且无较大差异。

2.5 胶体金试纸条特异性检测利用胶体金检测试纸条,对FCV毒株、FHP毒株、FIP毒株及FPV毒株的细胞培养毒进行检测,未发生交叉性反应(图2)。

图2 试纸条特异性试验结果

2.6 胶体金试纸条灵敏性检测将毒价107.5TCID50/mL的FCV细胞培养毒进行1∶10～ 1∶12 800系列稀释,制备的胶体金试纸条可检测到1 600倍稀释的标准病毒,3 200倍稀释显色不明显,灵敏度可达约104.3TCID50/mL(图3)。

图3 试纸条敏感性试验结果

2.7 稳定性检测用4℃保存3,6,9,12和15个月的试纸条分别检测检测FCV阳性样品,结果表明12个月以内试纸条检测结果一致,初步表明试纸条的保质期为12个月(图4)。

A.胶体金试纸条保存12个月检测结果;B.胶体金试纸条保存15个月检测结果

2.8 胶体金试纸条样品处理条件优化分别用PBS和公司购买的病毒采样管(活/灭活)处理实验室培养的FCV病毒样品和20份临床样品,利用自制的FCV胶体金试纸条对进行检测,结果表明对2种样品稀释液均可检测到病毒(图5),为便利和节省成本,选择PBS作为稀释液。

A.病毒采样管处理样品;B.PBS处理样品

2.9 胶体金诊断试纸条的初步应用用制备的胶体金试纸条与RT-PCR方法同时对76份猫鼻咽拭子进行检测,结果显示(表1), RT-PCR方法与所研制的试纸条的总体符合率为(40+30)/76=92.10%,两者符合率在90%以上。

表1 胶体金试纸条检测与RT-PCR检测结果比较 份

3 讨论

自从1998年美国加利福尼亚州报道了FCV强毒株引起猫的系统性全身性感染疾病( FCV-associated virulent systemic disease,FCV-VSD)以来[7],世界各地不断有高致死性变异FCV毒株的报道[7-9,17],其不仅危害家猫的健康[8,11,16],也严重威胁野生猫科动物,如老虎[18]、狮子等的健康,目前,用于FCV常规检测方法有病毒分离鉴定、中和试验及RT-PCR等,由于病毒分离及中和试验具有试验周期长等缺点,难以满足对FCV快速诊断的需要;而RT-PCR方法虽然灵敏,但由于受多种试验因素干扰,基层单位操作不方便,不能作为唯一的临床检测依据。因此,建立快速检测FCV的方法对预防和控制FCV的流行具有重要的意义。

本研究用临床分离的FCV毒株经培养、纯化、浓缩后,免疫BALB/c小鼠获得了5株FCV单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中4C3株除具有高的ELISA效价外,还具有较高的中和抗体效价,并且免疫家兔制备了兔多克隆抗体,用其制备了诊断FCV试纸条,结果显示,FCV检测试纸条具有特异性强、灵敏度高的特点。除与FCV病毒株呈阳性反应外与引起猫常见临床疾病的其他病毒均不反应,灵敏度可达约104.3TCID50/mL,对样品处理用PBS稀释样品即可达到满意的效果,分别用制备的胶体金试纸条与RT-PCR方法同时对76份猫鼻咽拭子进行检测,比较两者的符合率,符合率在90%以上,其中6份检测样品胶体金试纸条与RT-PCR检测结果不相符,原因可能是当检测样本中病毒量较少时,由于胶体金敏感度低于RT-PCR,胶体金试纸条呈阴性而RT-PCR阳性的检测结果;RT-PCR检测结果为阴性胶体金试纸条为阳性时,分析原因可能是RT-PCR操作较为复杂,结果呈假阴性。这为开发成品的FCV的快速、特异诊断试纸条奠定了基础,也为其他宠物病原检测诊断试纸条积累了经验。

本研究制备的5株单抗,其中有2株具有相同的抗原位点,均具有中和活性,下一步,继续筛选和制备新的单抗株,对杂交瘤细胞株分泌的单抗进行配对试验,选择成对单抗制备胶体金试纸条,将有可能增加检测试纸条的敏感性和特异性,以实现该检测品种的商品化。