淫羊藿苷对环磷酰胺致小鼠卵巢早衰的影响

薛美昭 ，赵均

1.山西中医药大学中药与食品工程学院，山西 晋中 030619；2.山西白求恩医院，同济山西医院，山西 太原 030032

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40岁前因卵巢功能衰竭而出现月经稀少或闭经4个月以上的妇科内分泌疾病，以闭经、雌激素缺乏、促卵泡激素（FSH）水平升高为主要表现，常伴有出汗、焦虑、抑郁、记忆力减退等症状[1]。POF病因复杂，目前已知的致病因素包括染色体异常、自身免疫性疾病、病毒感染等[2]。环磷酰胺是临床常用的烷化剂类化疗药物，其毒性可造成细胞DNA断裂，导致DNA、RNA及蛋白质合成受阻。卵巢是环磷酰胺生殖毒性的主要靶器官，研究表明，卵巢对化疗毒性非常敏感，化疗药物引发的POF占患病总人数的25%以上，许多化疗患者卵巢功能受到严重损伤，导致绝经期提前，卵巢功能紊乱，甚至不育[3]。

中医学认为，肾虚是POF发生的根本原因，冲任不调为POF发病关键因素[4]，因此常采用补肾法调节激素水平，改善POF临床症状[5]。淫羊藿为补肾助阳之要药，在治疗闭经、不孕、POF等卵巢功能失调性疾病方面有显著疗效[6]。淫羊藿苷是淫羊藿的有效成分之一，对生殖系统具有较好的保护作用[7]。本研究以环磷酰胺诱导小鼠POF模型，观察淫羊藿苷对模型小鼠血清性激素水平、卵巢病理形态及卵巢组织基因表达的影响，揭示淫羊藿苷治疗POF的作用机制，为中药防治POF提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康雌性C57BL/6小鼠30只，6周龄，体质量（18±1）g，购于山西医科大学动物实验中心，饲养于该动物中心屏障动物房，温度（25±2）℃，湿度（55±2）%，光暗循环12 h，自由进食饮水。本研究经山西中医药大学医学伦理委员会批准（2019LL197）。

1.2 主要试剂与仪器

淫羊藿苷（货号I8760，北京索莱宝），环磷酰胺（货号C0768，德国Sigma），小鼠雌二醇（E2）ELISA试剂盒（货号E-EL-0150c，武汉Elabscience），FSH ELISA试剂盒（货号E-EL-M0511c，武汉Elabscience），多聚甲醛（货号P1110，北京索莱宝），HE染色试剂盒（货号G1120，北京索莱宝），Trizol（货号DP424，北京天根），Rnase-free water（货号R1600，北京索莱宝），反转录试剂盒（货号AG11728，湖南艾科瑞生物），PCR检测试剂盒（货号Q711-03，南京诺唯赞）。台式高速冷冻离心机（型号H1650R，湖南赛特湘仪），酶标仪（型号Elx800，美国Bio-Tek），电泳仪（型号DYY-6C，北京六一仪器），凝胶成像仪（型号ChemiDocXRS+，美国Bio-Rad），核酸蛋白检测仪（型号BioPhotometer D30，德国Eppendorf），荧光定量PCR仪（型号QuantStudio 7 Flex，美国ABI）。

1.3 分组、造模及给药

小鼠适应性饲养1周后行阴道涂片，将30只动情周期正常的小鼠随机分为对照组、模型组和淫羊藿苷组，每组10只。模型组和淫羊藿苷组腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg制备POF小鼠模型，1次/d，连续14 d，对照组注射等量生理盐水。造模结束后次日，淫羊藿苷组予淫羊藿苷溶液（用生理盐水制备成浓度为1 g/L溶液）25 mg/kg灌胃，1次/d，连续28 d。对照组和模型组灌胃等量生理盐水。

1.4 一般状况观察

造模和给药过程中，观察小鼠活动情况、精神状态、皮毛光泽度、对外界反应的灵敏度、进食量等情况，每周称量并记录小鼠体质量变化。

1.5 ELISA检测

分别于造模及干预结束后，摘眼球取血，血液室温静置2 h，3 000 r/min离心15 min，收集上层血清，ELISA检测血清E2和FSH含量。

1.6 卵巢组织病理观察

干预结束后，颈椎脱臼处死小鼠，取双侧卵巢，剥离周围脂肪组织，称量卵巢质量。将一侧卵巢用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，并进行HE染色。光学显微镜下观察卵巢组织形态，并对各级卵泡数量进行统计。

1.7 卵巢组织mRNA转录组分析

取另一侧卵巢，分别放入标记好的冻存管中，迅速置于液氮中冻存。采用Trizol法提取总RNA，检测RNA完整性、浓度及纯度，质控合格后送至北京诺禾致源科技股份有限公司，利用Illumina测序平台进行高通量测序及生物信息学分析。

1.8 RT-qPCR验证差异表达mRNA

质检合格的总RNA反转录合成cDNA，PCR条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料以±SE表示，组间比较用方差分析，方差齐用Duncan检验，方差不齐用多重比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淫羊藿苷对模型小鼠一般状况的影响

对照组小鼠精神状态良好，活动敏捷，皮毛光滑，反应灵敏；模型组小鼠随造模时间延长，进食量逐渐减少，形体消瘦，反应迟钝，皮毛黯淡，体质量较对照组减轻；淫羊藿苷组小鼠进食量增加，反应较敏捷，皮毛稍有光泽，体质量较模型组增加。

2.2 淫羊藿苷对模型小鼠血清雌二醇、促卵泡激素含量的影响

与对照组同一时点比较，模型组和淫羊藿苷组小鼠14 d血清E2含量显著减少，FSH含量显著增加（P<0.05），模型组小鼠42 d血清E2含量显著减少，FSH含量显著增加（P<0.05）；与模型组同一时点比较，淫羊藿苷组小鼠42 d血清E2含量显著增加，FSH含量显著减少（P<0.05）。结果见表2。

表2 各组小鼠血清E2和FSH含量比较（±SE）

表2 各组小鼠血清E2和FSH含量比较（±SE）

注：与同一时点对照组比较，*P<0.05；与同一时点模型组比较，#P<0.05

组别对照组模型组淫羊藿苷组只数10 10 10 E2/（pg/mL）14 d 52.57±1.76 30.89±2.14*32.67±1.07*42 d 54.25±1.65 29.21±1.78*48.11±1.56*#FSH/（ng/mL）14 d 3.08±0.11 4.68±0.58*4.73±0.52*42 d 3.17±0.12 4.70±0.57*3.31±0.60#

2.3 淫羊藿苷对模型小鼠卵巢质量及病理形态的影响

与对照组比较，模型组小鼠卵巢质量显著减少（P<0.05）；与模型组比较，淫羊藿苷组小鼠卵巢质量显著增加（P<0.05）。结果见表3。

表3 各组小鼠卵巢质量比较（±SE，mg）

表3 各组小鼠卵巢质量比较（±SE，mg）

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

组别对照组模型组淫羊藿苷组只数10 10 10卵巢质量12.2±2.1 7.3±1.7*11.6±1.9#

HE染色显示，对照组小鼠卵泡发育正常、生长活跃，可见各级卵泡，卵泡液丰富，颗粒细胞层次多；模型组小鼠各级卵泡数目减少，颗粒细胞层次少，卵巢明显萎缩；淫羊藿苷组小鼠颗粒细胞层次增加，各级卵泡数量较模型组明显增多。见图1。

图1 各组小鼠卵巢组织形态（HE染色，×40）

与对照组比较，模型组小鼠原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量均显著减少（P<0.05）；与模型组比较，淫羊藿苷组小鼠原始卵泡、初级卵泡和成熟卵泡数量均显著增加（P<0.05）。结果见表4。

表4 各组小鼠各级卵泡数比较（±SE，个）

表4 各组小鼠各级卵泡数比较（±SE，个）

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

组别对照组模型组淫羊藿苷组只数10 10 10原始卵泡280.0±19.9 183.7±10.5*213.3± 9.8#初级卵泡147.0±12.1 67.0±12.3*110.0± 9.6#次级卵泡72.0±7.6 35.3±6.3*50.7±4.3成熟卵泡65.3±7.2 31.3±1.9*46.7±8.4#

2.4 淫羊藿苷对模型小鼠基因转录组的影响及差异基因RT-qPCR验证

对模型组/对照组、淫羊藿苷组/模型组卵巢组织基因表达进行分析，以|log2模型组/对照组|≥1为筛选条件，结合P<0.05，共筛选出8个与卵巢组织功能相关的基因。与对照组比较，模型组小鼠卵巢组织Mafg、Gcnt3基因表达上调，Oas1h、Smc1b、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP基因表达下调（P<0.05）；与模型组比较，淫羊藿苷组小鼠卵巢组织上述基因表达显著逆转（P<0.05）。结果见表5。

表5 各组小鼠卵巢组织差异表达基因筛选结果

基于转录组分析结果，选择5个基因（Gcnt3、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP）通过RT-qPCR进行验证，验证结果与高通量测序结果一致。结果见表6。

表6 各组小鼠卵巢组织Gcnt3、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP基因表达比较（±SE）

表6 各组小鼠卵巢组织Gcnt3、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP基因表达比较（±SE）

注：与模型组/对照组比较，*P<0.05

基因名称Gcnt3 Mov10l1 Oosp2 Tbpl2 DynAP模型组/对照组10.82±0.85 0.05±0.00 0.24±0.01 0.19±0.03 0.12±0.00淫羊藿苷组/模型组0.42±0.01*4.31±0.04*2.28±0.07*2.51±0.39*3.38±0.24*

3 讨论

根据POF发病特点，可将其归中医学“血枯”“不孕”“经水早断”等范畴，相似证治散见于“闭经”“经水不通”“月经后期”等[8]。肾藏精，主生长、发育与生殖。肾中精气充盛，天癸成熟，月经来潮，标志着女性卵巢生殖周期活动开始；肾中精气衰退，天癸耗竭，月经闭绝，提示女性卵巢生殖功能结束。POF病机多为肾中精血不足，阴阳失调，命门火衰所致。中医采用补肾法治疗POF，可有效改善和恢复卵巢功能[5]。药理研究表明，淫羊藿中的黄酮类化合物作为其最主要的有效成分，具有多种生物活性[9]，其中，淫羊藿苷占比较大。多项研究表明，淫羊藿苷可增加碱性磷酸酶活性，降低抗酒石酸酸性磷酸酶活性，刺激E2产生；淫羊藿苷可调节下丘脑-垂体-卵巢轴功能，已被广泛应用于月经不调、POF等疾病的治疗中[10]。

环磷酰胺对卵巢具有较强的毒副作用。本实验利用环磷酰胺建立POF小鼠模型，与对照组比较，模型组小鼠卵巢质量显著下降，血清E2含量显著减少，FSH含量显著增加，同时卵巢组织各级卵泡数量显著减少，表明环磷酰胺能够破坏小鼠卵巢结构，降低卵巢储备功能。而使用淫羊藿苷治疗后，小鼠卵巢质量显著增加，E2含量显著增加，FSH含量显著减少，原始卵泡、初级卵泡和成熟卵泡数量均显著增加。表明淫羊藿苷通过降低模型小鼠血清FSH水平、提高E2水平，增加大鼠卵巢质量和卵泡数量，从而增强卵巢储备功能，对环磷酰胺所致小鼠POF有明显缓解作用。

对各组小鼠卵巢组织基因表达谱进行对比分析发现，表达水平显著改变的均是参与编码生殖细胞发生和生长关键蛋白质和细胞因子的基因。Mafg是编码含亮氨酸拉链的转录因子，该基因在致癌因子等刺激下高表达，进而促进细胞恶化并缩短存活时间[11]。Gcnt3编码黏连蛋白合酶，在受到病毒等外界刺激后能够通过ERK信号通路促进细胞恶性增殖和迁移[12]。本实验中，Mafg和Gcnt3基因在模型组小鼠卵巢组织表达显著上调，推测卵巢组织受到环磷酰胺刺激后细胞的恶化进程加快，与文献结果[11-12]一致。而淫羊藿苷干预后，Mafg和Gcnt3基因表达均有所下降。Oas1h基因编码寡聚核苷酸合成酶，参与细胞因子TNF/NF-κB信号通路，调控生殖细胞对病毒感染的免疫反应[13]。Smc1b基因编码减数分裂相关的黏连蛋白，调控姐妹染色单体配对及阻止端粒缩短，从而维持基因组的稳定性[14]。Mov10l1基因编码RNA解旋酶，属于卵巢细胞的特定表达酶，参与调控卵巢发育和配子形成过程[15]。Oosp2基因编码与透明带相关的结构蛋白，在女性生育力进程中起关键作用，该基因缺失表现为生育力降低[16]。Tbpl2基因编码与TATA结合的转录因子，该蛋白与TFⅡA形成复合体调控与卵母细胞生长相关基因的表达[17]。DynAP基因编码一种定位于高尔基体脂膜的跨膜蛋白，能够激活AKT信号通路，促进细胞增殖，当细胞中缺失DynAP基因时则会诱导细胞凋亡[18]。上述6个基因在模型组小鼠卵巢组织表达显著下调，表明卵巢细胞受到环磷酰胺刺激后对外部刺激的免疫反应、基因组的稳定性、生殖细胞分裂与增殖能力均受到严重损伤。淫羊藿苷干预后，以上基因表达水平明显恢复，表明淫羊藿苷对环磷酰胺造成的卵巢损伤有明显的治疗作用。

综上所述，淫羊藿苷可通过调控编码卵巢细胞发生和生长相关蛋白质和细胞因子的基因表达，升高血清E2并降低FSH激素水平，增加卵巢质量，增加原始卵泡、初级卵泡和成熟卵泡数量，进而对POF起到治疗作用。