活血通络汤对抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎患者内皮祖细胞功能及血管内皮损伤因子的影响

尹千璐 ，周小莉 ，王淼 ，熊川 ，郑宇航 ，廖为翔 ，王卓君

1.贵州中医药大学研究生院，贵州 贵阳 550025；2.重庆市中医院，重庆 400021

抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）是一种全身性自身免疫性疾病，以血管炎症、内皮损伤和组织损伤为特点，迁延难愈，且容易复发[1]。内皮祖细胞（EPCs）在维持内皮功能完整性及修复内皮损伤方面具有重要作用，其数量及功能受损可导致血管内皮修复功能下降，并可能导致AAV早期复发及反复发作[2]。

根据其病变部位及临床表现，AAV可归属中医学“脉痹”“络痹”范畴。瘀阻络损是AVV核心病机，贯穿AAV发展及演变过程。活血通络汤由重庆市名老中医张嗣兰拟定，现为重庆市中医院周围血管（创面修复）科临床治疗AAV缓解期常用方。本研究观察活血通络汤对AAV患者外周血EPCs功能的影响，初步探讨其治疗AAV的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞

外周血EPCs来自2020年7月－2022年6月重庆市中医院符合AAV诊断标准[3-5]的患者及健康志愿者。

患者纳入标准：①年龄18～70岁，性别不限；②近4周糖皮质激素用量≤5 mg/d，服用免疫抑制剂不超过1种；③符合系统性小血管炎低活动度，伯明翰系统性血管炎活动评分（BVAS）<15分。④知情并签署同意书。排除标准：①患有其他结缔组织疾病者；②原发造血系统疾病患者；③近期行外科手术、受外伤、重症感染等患者；④合并严重高血压病、糖尿病、高血脂、肿瘤等疾病。

共入选患者30例，其中男性13例、女性17例，平均年龄（48.93±16.90）岁，包含显微镜下多血管炎、肉芽肿性多血管炎、嗜酸性肉芽肿性多血管炎。同时，招募年龄相近的健康志愿者10名，其中男性4名、女性6名，平均年龄（45.60±15.78）岁。本研究经重庆市中医院伦理委员会审查批准（2020-ky-64）。

1.2 动物

雄性成年清洁型SD大鼠10只，体质量（200±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（湘）2019-004。饲养于重庆市中医院SPF级动物实验室，温度（23±2）℃，湿度45%～55%，自由摄食饮水。

1.3 药物及制备

活血通络汤（当归尾15 g，赤芍10 g，川芎10 g，桃仁10 g，红花10 g，香附10 g，青皮10 g，王不留行10 g，牡丹皮10 g，牛膝10 g），饮片购于重庆市中医院中药房，加水常规煎煮2次，过滤，合并滤液，加热浓缩至原药材浓度为2.0 g/mL，4 ℃冰箱保存备用。

1.4 主要试剂与仪器

Optiprep淋巴细胞分离液，北京索莱宝，批号07820；胎牛血清，上海李记生物科技公司，批号1050B0802；胰蛋白酶，美国HyClone公司，批号H120711；M199培养基，美国HyClone公司，批号SH30253.01；Dil-ac-LDL，广州奕源生物科技公司，批号YB-0013；FITC-UEA-1，上海复申生物科技公司，批号FS1109-1000μg；MTT细胞增殖检测试剂盒，广州科联生物技术公司，批号70-MTT002；Transwell嵌套（24孔，8 μm），美国康宁生物科技公司，批号3422；PVDF膜，德国Amersham，批号10600023；β-actin，美国Abclonal公司，批号AC026；可溶性血栓调节蛋白（sTM）抗体，美国Abclonal公司，批号A1235；血管性假性血友病因子（vWF）抗体，美国Abclonal公司，批号A12357；10%PAGE凝胶快速制备试剂盒，上海雅酶生物科技公司，批号PG112；蛋白预染Marker，上海雅酶生物科技公司，批号WJ103；蛋白上样缓冲液，上海雅酶生物科技公司，批号LT101S。1384型超净工作台，美国Thermo公司；-20 ℃低温冰箱，美国Thermo公司；311型二氧化碳培养箱，美国Thermo公司；EVOS M5000荧光显微镜，美国Thermo公司；ST16型高速离心机，美国Thermo公司；Synergy HTX型多功能酶标仪，美国BioTek公司；Universal Hood Ⅱ型核酸蛋白凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 内皮祖细胞分离、培养及鉴定

抽取入选患者及健康志愿者空腹肘正中静脉血10 mL，以8∶1比例加入Optiprep淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法收集细胞，PBS洗涤3次，每次1 000 r/min离心5 min，用M199完全培养基（含20%胎牛血清、10 μg/L血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子）重悬，以5×105个/mL密度接种于12孔板，每隔2 d换液1次。

培养7 d后，用PBS清洗未贴壁及死亡的细胞2次，避光条件下加入含10 mg/L Dil-ac-LDL的M199培养基，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育3 h，4%多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗，避光条件下加入2.4 mg/L FITC-UEA-1，放入培养箱孵育3 h。封片，荧光显微镜下观察，鉴定EPCs。

2.2 含药血清制备

大鼠适应性饲养3 d后随机分为空白组和含药血清组，每组5只。参照Meeh-Rubner公式[6]，根据体质量与体表面积换算方法折算等效剂量，含药血清组每日予10倍等效剂量（15.75 g/kg）活血通络汤灌胃，空白组予等体积生理盐水灌胃，12 h灌胃1次，连续7 d。末次灌胃后2 h，5%水合氯醛麻醉大鼠，无菌条件下腹主动脉取血，4 ℃静置2 h，3 000 r/min离心15 min，分离血清，同组血清合并，56 ℃水浴30 min灭活，经0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃冰箱保存备用。

2.3 分组及干预

设置正常组、模型组、空白血清组（10%空白血清）和活血通络汤低（5%含药血清）、中（10%含药血清）、高（20%含药血清）剂量组，每组3个复孔。将鉴定成功的EPCs以2.5×105个/mL密度接种至24孔板，正常组接种健康志愿者EPCs，其余各组接种AAV患者EPCs，置于培养箱培养过夜，次日取出培养板，弃去培养基，分别加入对应培养基继续培养48 h，正常组和模型组加入M199完全培养基。

2.4 指标检测

2.4.1 MTT法检测细胞增殖

干预48 h后，弃去培养基，PBS清洗2次，每孔加入MTT溶液100 μL和培养基900 μL，于培养箱中继续培养3 h，弃上清液，加入适量二甲基亚砜，水平振荡10 min后，酶标仪波长570 nm检测各孔吸光度（OD值）。

2.4.2 迁移能力检测

按“2.3”项下分组干预，吸取细胞悬液200 μL，加入24孔板的Transwell小室上室，下室加入对应培养基培养48 h，取出Transwell小室，用棉签蘸取PBS去除上室残留细胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3次，行吉姆萨染色，室温避光孵育1 h，去除染色液，PBS洗涤3次，显微镜下（×200）观察，随机选取5个视野计数迁移至下室的细胞。

2.4.3 黏附能力检测

按“2.3”项下分组干预，吸取细胞悬液200 μL接种至预先包被明胶的24孔培养板，每孔加入300 μL培养基（正常组和模型组加入M199完全培养基，其余各组加入含相应血清的培养基），置于培养箱中培养12 h，弃去上清液和非贴壁细胞，加入PBS，倒置显微镜下（×200）随机选取5个视野计数细胞贴壁情况。

2.4.4 Western blot检测

干预48 h后收集细胞，用细胞裂解液充分裂解，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液，根据BCA蛋白浓度定量试剂盒操作说明测定蛋白浓度，每个样品上样量20 μg。SDS-PAGE分离蛋白，转移至PVDF膜，血清封闭1 h，滴加vWF、sTM一抗（1∶1 000），4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗涤3次；滴加二抗（1∶2 000），室温摇床孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL显色，成像仪曝光检测。以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

3 统计学方法

采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 内皮祖细胞培养及鉴定

分离的EPCs呈较小的圆形，悬浮于培养液中，细胞接种后开始沉降贴壁，随着细胞贴壁生长，体积逐渐增大。EPCs呈椭圆形、长梭形、纺锤形等多种形态，光镜下可见线性样（见图1A）、团簇样（见图1B）、网格样（见图1C）生长。第10日左右达到增殖高峰，然后开始逐渐老化、死亡，第28日左右基本完全死亡。健康志愿者和患者EPCs形态无明显差异。

图1 EPCs形态（×400）

通过免疫荧光双染进行鉴定，荧光显微镜下观察，Dil-ac-LDL（红色）和FITC-UEA-1（绿色）双染阳性细胞可鉴定为EPCs。见图2。

图2 EPCs鉴定（免疫荧光染色，×200）

4.2 活血通络汤对内皮祖细胞增殖能力的影响

与正常组比较，模型组EPCs增殖能力显著降低（P<0.01）；与模型组及空白血清组比较，活血通络汤各剂量组EPCs增殖能力显著升高（P<0.05，P<0.01）。活血通络汤促进EPCs增殖能力随剂量增加而升高（P<0.01）。结果见表1。

表1 各组EPCs增殖能力比较（±s）

表1 各组EPCs增殖能力比较（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与空白血清组比较，▽▽P<0.01；与活血通络汤低剂量组比较，▲▲P<0.01；与活血通络汤中剂量组比较，▼▼P<0.01

组别正常组模型组空白血清组活血通络汤低剂量组活血通络汤中剂量组活血通络汤高剂量组n3 3 3 3 3 3 OD值0.91±0.08 0.53±0.10**0.50±0.06**0.66±0.05**△▽▽0.79±0.16**△△▽▽▲▲0.96±0.08*△△▽▽▲▲▼▼

4.3 活血通络汤对内皮祖细胞迁移能力的影响

与正常组比较，模型组EPCs迁移能力显著降低（P<0.01）；与模型组及空白血清组比较，活血通络汤各剂量组EPCs迁移能力显著升高（P<0.01），以活血通络汤高剂量组促进EPCs迁移能力最显著（P<0.01）。结果见表2。

表2 各组EPCs迁移能力比较（±s，个/200倍视野）

表2 各组EPCs迁移能力比较（±s，个/200倍视野）

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01；与空白血清组比较，▽▽P<0.01；与活血通络汤低剂量组比较，▲▲P<0.01；与活血通络汤中剂量组比较，▼▼P<0.01

组别正常组模型组空白血清组活血通络汤低剂量组活血通络汤中剂量组活血通络汤高剂量组n3 3 3 3 3 3迁移细胞数138.37±9.79 74.17±5.50**75.17±5.76**105.50±8.80**△△▽▽118.03±10.56**△△▽▽▲▲148.70±6.47*△△▽▽▲▲▼▼

4.4 活血通络汤对内皮祖细胞黏附能力的影响

与正常组比较，模型组EPCs黏附能力显著降低（P<0.01）；与模型组及空白血清组比较，活血通络汤各剂量组EPCs黏附能力显著升高（P<0.05，P<0.01）。活血通络汤促进EPCs黏附能力随剂量增加而升高（P<0.01）。结果见表3。

表3 各组EPCs黏附能力比较（±s，个/200倍视野）

表3 各组EPCs黏附能力比较（±s，个/200倍视野）

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与空白血清组比较，▽▽P<0.01；与活血通络汤低剂量组比较，▲▲P<0.01；与活血通络汤中剂量组比较，▼▼P<0.01

组别正常组模型组空白血清组活血通络汤低剂量组活血通络汤中剂量组活血通络汤高剂量组n3 3 3 3 3 3黏附细胞数308.67±32.06 176.23±33.76**181.06±19.01**215.80±25.46**△▽▽265.77±18.52**△△▽▽▲▲326.07±27.71*△△▽▽▲▲▼▼

4.5 活血通络汤对内皮祖细胞血管性假性血友病因子、可溶性血栓调节蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组EPCs vWF、sTM蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组及空白血清组比较，活血通络汤各剂量组EPCs vWF、sTM蛋白表达显著降低（P<0.01）；与活血通络汤低剂量组比较，活血通络汤中、高剂量组EPCs vWF、sTM蛋白表达显著降低（P<0.01，P<0.05）；与活血通络汤中剂量组比较，活血通络汤高剂量组EPCs vWF、sTM蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。见图3、表4。

图3 各组EPCs vWF和sTM蛋白免疫印迹

表4 各组EPCs vWF和sTM蛋白表达比较（±s）

表4 各组EPCs vWF和sTM蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与空白血清组比较，▽P<0.05，▽▽P<0.01；与活血通络汤低剂量组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与活血通络汤中剂量组比较，▼P<0.05，▼▼P<0.01

组别n vWF sTM正常组模型组空白血清组活血通络汤低剂量组活血通络汤中剂量组活血通络汤高剂量组3 3 3 3 3 3 0.46±0.03 0.74±0.02**0.71±0.16**0.65±0.01**△△▽▽0.57±0.04**△△▽▽▲▲0.51±0.21*△△▽▽▲▲▼▼0.36±0.14 0.68±0.04**0.66±0.06**0.58±0.07**△▽0.48±0.03**△△▽▽▲0.41±0.26*△△▽▽▲▲▼

5 讨论

EPCs是一种骨髓源性细胞，又称血管母细胞，在一定条件下可迁移到外周循环，能够分化为成熟的血管内皮细胞，并且分泌多种细胞因子和血管生长因子，参与血管稳定、新血管形成及内膜损伤修复[6]。研究表明，很多慢性炎症和自身免疫性疾病中EPCs数量和功能发生改变[7-8]。血管内皮损伤是AAV的主要特征，血管内皮细胞是血管炎的靶器官，参与血管炎的病情进展[9]。即使在AAV缓解状态，凝血和免疫系统的持续激活及低度炎症状态也会导致持续的血管内皮损伤，这可能是导致AAV复发的根本原因[10]。循环EPCs可以提供内源性修复机制降低AAV的内皮损伤，与健康人相比，AAV患者循环EPC数量减少、活性降低[11]。本研究也发现，AAV患者EPCs增殖、迁移、黏附能力明显低于健康志愿者。

sTM是公认的内皮损伤标志物，在维持血液流动和防止血管内凝血方面发挥重要作用。在AAV患者中，sTM水平与血管炎过程中血管内皮损伤程度相关，能反映血管、尤其是小血管和毛细血管内皮细胞受损程度[12]。vWF是反映细胞损伤敏感的分子标记物，参与血小板黏附、聚集。在AAV患者中，由于血管内皮细胞损伤，导致vWF大量产生与释放，加速血小板黏附和聚集，进一步促进血管炎形成与发展，导致内皮损伤加重[13]。故vWF和sTM可能是AAV进展及复发的潜在标志物。本研究纳入缓解期AAV患者（BVAS<15分），与正常组比较，模型组EPCs vWF和sTM蛋白表达显著升高，提示即使在AAV缓解期也存在持续的血管内皮损伤或内皮损伤修复机制受损，并可能导致患者病情反复。

糖皮质激素、免疫抑制及生物制剂等治疗可缓解AAV，显著降低病死率。在缓解后需长期免疫抑制剂维持治疗，但即使维持性免疫抑制，仍有超过50%患者在5年内病情复发[14]。目前在缓解维持期缺乏更安全有效的治疗方案。

AAV病理基础为自身免疫异常导致的小血管炎，且反复发作，久治不愈，与中医学“久病入络”“久病在络，气血皆窒”等络病学说认识一致[15]。奚九一教授总结免疫性血管炎的基本病理过程为因邪（内因与外因致病因子、血管炎变）→致瘀（血管狭窄、纤维组织增生与血液改变、血栓形成、新与旧）→损伤（缺血与瘀血的组织反应）[16]。故“瘀阻络损”贯穿AAV发展及演变整个过程，是其核心病机，活血通络是AAV的基本治法。中药可调控EPCs相关因子及通路，改善心肌缺血损伤[17]，其中活血化瘀中药可增强EPCs动员、增殖、迁移、分化和黏附功能，还能促进细胞因子分泌，促进内皮修复和血管新生[18]。活血通络汤由当归尾、赤芍、川芎、桃仁、红花、香附、青皮、王不留行、牡丹皮、牛膝组成。方中当归尾甘、辛，性温，活血祛瘀，为君药；川芎辛温香窜，行气活血，为血中气药，赤芍活血化瘀止痛，二药相伍，既增活血化瘀之功，又借气行血行之力，使行血破滞之功倍增，共为臣药；红花活血祛瘀，香附疏肝理气止痛，青皮疏肝破气、消积化滞，王不留行活血通络，牡丹皮清热凉血、活血化瘀，共为佐药；牛膝逐瘀通络、引血下行为使药。全方共奏活血祛瘀、行气通络之功。本研究结果显示，活血通络汤可能通过提高EPCs增殖、迁移与黏附能力参与AAV缓解期血管内皮损伤的修复，其作用机制与降低血管内皮损伤因子vWF、sTM蛋白表达有关。中药复方存在多靶点、多途径的调节作用，参与的调控因子繁多，机制复杂，本课题组将进一步研究活血通络汤治疗AAV的其他作用途径和调控因子。