锁阳黄酮对阿尔茨海默病大鼠海马组织ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表达的影响

吕鑫 ，顾志荣 ，祁梅 ，郭燕 ，毛小文 ，葛斌

1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是以起病隐匿、进行性发展为临床特征的神经退行性疾病，主要表现为全面性认知功能损伤[1]。调查显示，我国60岁及以上人群中AD患者约占痴呆症患者的65.23%，已成为我国严重公共卫生问题之一[2]。AD主要病理表现为β淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成老年斑、Tau蛋白异常磷酸化形成神经原纤维缠结、炎症反应等[3]。研究表明，Nod样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体是诱发动脉粥样硬化、2型糖尿病、AD等疾病的危险因素，活性氧（ROS）是NLRP3炎性小体激活的经典途径[4]，NADPH氧化酶是细胞内产生ROS的关键酶，由膜亚基gp91phox、p22phox和胞浆亚基p47phox、p67phox等组成（phox表示来源于吞噬细胞）。当机体处于正常状态时，上述亚基不具备活性；当受到刺激后，各亚基在细胞膜上集合与装配，形成有活性的NADPH氧化酶复合体，催化生成大量ROS，进一步激活NLRP3炎性小体，释放炎症因子[5]。因此，以NADPH氧化酶各亚基为切入点，减少ROS生成，进而抑制炎症因子释放，可实现神经保护。

中医学认为，AD由肾精不足、脑髓渐空所致[6]。锁阳是中医、蒙医常用补肾益精药，其有效部位锁阳黄酮具有抗氧化[7]、延缓衰老[8]、清除自由基及抗癌[9]等多种药理活性。研究表明，锁阳提取物具有防治AD的潜能[10-11]。本研究观察锁阳黄酮对AD大鼠海马组织ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表达的影响，为AD防治提供新思路和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性Wistar大鼠70只，4月龄，体质量（250±50）g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，动物生产许可证号SCXK（甘）2020-0002，动物使用许可证号SYXK（甘）2020-0006。饲养于甘肃省药品检验研究院SPF级动物实验室，温度（20±2）℃，湿度35%～55%，12 h光照/黑暗交替，适应性饲养7 d。

1.2 药物及制备

锁阳，2021年3月采集于内蒙古，经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李硕副教授鉴定为锁阳Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉质茎。将新鲜锁阳晾至完全干透，粉碎，过2号筛，60 ℃烘干，加12倍量65%乙醇，80 ℃回流提取2 h，趁热过滤，滤液浓缩至无醇味，用HPD-826型大孔吸附树脂对提取物进行动态吸附，将洗脱液浓缩，真空干燥，得到纯化后的锁阳黄酮（纯度88.86%），用生理盐水分别配制成浓度为 2.5、5、10 mg/mL 溶液。Aβ1-42（批号04010011827），强耀生物科技有限公司，将1 mg Aβ1-42冻干粉溶于50 μL DMSO中，加水至200 μL，稀释成5 μg/μL，分装，避光贮存于-80 ℃冰箱备用。盐酸多奈哌齐（批号2010023），卫材（中国）药业有限公司，用生理盐水配制成0.05 mg/mL水溶液。

1.3 主要试剂与仪器

DAB试剂盒（货号ZLI-9018），北京中杉金桥；ROS试剂盒（货号ZC-36726），上海茁彩；BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号P0009），上海碧云天；Aβ1-42抗体（货号25524-1-AP），武汉三鹰；gp91phox抗体（货号A1636）、p47phox抗体（货号A1148）、p67phox抗体（货号A3703）、NLRP3抗体（货号A5652）、β-actin抗体（货号AC026），武汉爱博泰克；白细胞介素（IL）-1β抗体（货号bs-0812r）、p22phox抗体（货号bs-3879r），北京博奥森。大鼠脑立体定位仪（型号WT-200）、Morris水迷宫（型号MT-200），成都泰盟；数字切片扫描仪（型号Pannoramic 250），匈牙利3DHIESTECH公司；酶标仪（型号SpectraMAX Plus384），上海美谷；化学发光成像仪（型号5200），上海天能科技；RT-PCR仪（型号QuantStudioTM3），美国赛默飞。

1.4 造模

70只大鼠随机选取10只作为空白组、10只作为假手术组，剩余50只大鼠进行造模。腹腔注射3%戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉大鼠，头部备皮，纵行切口，暴露前囟门，参照脑立体定位坐标[12]确定海马位置（前囟后沿中线移3.0 mm，左右各旁开2.2 mm，硬脑膜下深3 mm），用牙科钻在颅骨上钻孔（直径约1 mm），用微量进样器在双侧海马分别注射Aβ1-42溶液1 μL，留针5 min，缓慢退针。于伤口处撒适量青霉素，缝合皮肤，碘伏消毒，单笼饲养。空白组不予任何处理，假手术组注射等体积生理盐水。

1.5 分组及给药

将成模大鼠随机分为模型组、多奈哌齐组及锁阳黄酮低、中、高剂量组，每组10只。术后3 d开始给药，多奈哌齐组予多奈哌齐溶液0.5 mg/kg灌胃，锁阳黄酮低、中、高剂量组分别予锁阳黄酮溶液25、50、100 mg/kg灌胃，体积1 mL/100 g，每日1次，连续28 d。空白组、假手术组及模型组灌胃等体积生理盐水。

1.6 行为学检测

从给药第21天开始，通过Morris水迷宫实验[13]评价大鼠学习记忆能力。包括定位航行（21～25 d）和空间探索（26 d）两部分，分别记录大鼠末次60 s内逃避潜伏期、跨平台次数和目标象限停留时间。

1.7 取材

末次行为学检测结束后，采用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，股动脉取血，静置2 h，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，分离血清，-80 ℃保存，用于ELISA检测。取血后脱颈处死大鼠，3只取全脑于4%多聚甲醛中固定，用于HE及免疫组化染色；剩余大鼠冰上迅速取脑并分离双侧海马组织，液氮速冻，-80 ℃保存，用于ELISA、Western blot及RT-PCR检测。

1.8 HE染色

固定的脑组织经全自动脱水机脱水后，石蜡包埋，切片，HE染色，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察海马组织病理变化。

1.9 免疫组化染色

脑组织经固定、脱水、包埋、切片后，进行抗原修复、血清封闭，滴加Aβ1-42一抗（1∶50），4 ℃孵育过夜，滴加二抗，常温孵育1 h，DAB显色，复染细胞核，脱水封片，以黄色或棕黄色为阳性表达，使用Halo数据分析系统计算每张图像阳性面积占比。

1.10 ELISA检测

取海马组织及血清，海马组织按质量/体积比1∶9加入PBS，使用组织研磨仪进行匀浆，匀浆液4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书测定海马组织及血清ROS含量。

1.11 Western blot检测

取海马组织，加入3 mm钢珠及RIPA裂解液，置于-20 ℃高速低温组织研磨仪内研磨4次，每次60 s，4 ℃冰箱裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。按4∶1比例加入5×loading buffer，混匀后热循环仪95 ℃、15 min进行蛋白变性。凝胶电泳、转膜、封闭后，滴加gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、IL-1β、NLRP3 一抗（1∶2 000）和β-actin一抗（1∶100 000），4 ℃孵育过夜，滴加二抗（1∶5 000），室温孵育2～3 h。超敏ECL曝光，凝胶成像系统扫描条带，计算蛋白相对表达量。

1.12 RT-PCR检测

TRIzol法提取海马组织总RNA，测定RNA浓度，使用cDNA反转录试剂盒进行反转录。配制PCR体系进行扩增，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃充分延伸，采集荧光30 s，共45个循环。采用2-ΔΔCt法计算mRNA表达量。引物由生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.13 统计学方法

采用SPSS23.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，组间比较用方差分析，方差齐用LSD检验，方差不齐用Dunnett's T3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 锁阳黄酮对模型大鼠行为学的影响

与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.01），跨平台次数和目标象限停留时间明显减少（P<0.01）；与模型组比较，多奈哌齐组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.01）、跨平台次数和目标象限停留时间明显增加（P<0.05，P<0.01），锁阳黄酮低剂量组大鼠目标象限停留时间明显增加（P<0.05），锁阳黄酮中剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.01）、目标象限停留时间明显增加（P<0.01），锁阳黄酮高剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.01）、跨平台次数和目标象限停留时间明显增加（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

表2 各组大鼠Morris水迷宫实验学习记忆能力比较（±s）

表2 各组大鼠Morris水迷宫实验学习记忆能力比较（±s）

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，&P<0.05，&&P<0.01

组别空白组假手术组模型组多奈哌齐组锁阳黄酮低剂量组锁阳黄酮中剂量组锁阳黄酮高剂量组只数10 10 10 10 10 10 10逃避潜伏期/s 16.42±3.42 17.69±6.04 37.37±4.76**20.17±4.81&&34.54±7.82 25.12±4.12&&19.52±4.54&&跨平台次数4.9±2.02 5.6±2.07 1.8±1.23**3.8±1.81&2.6±1.58 3.1±1.73 3.7±2.00&目标象限停留时间/s 28.07±7.01 33.01±9.44 10.59±3.48**25.13±8.77&&18.20±8.28&21.75±5.83&&22.88±7.58&&

2.2 锁阳黄酮对模型大鼠海马组织病理形态的影响

空白组和假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞排列正常，未见明显细胞坏死、胶质细胞增生及炎性细胞浸润；与假手术组比较，模型组大鼠海马CA1区锥体细胞凋亡明显，细胞结构模糊，胞质染色加深，胞核边界不清晰，局部锥体细胞排列紊乱；与模型组比较，多奈哌齐组及锁阳黄酮中、高剂量组大鼠海马CA1区锥体细胞排列较正常，凋亡等病理形态有所改善。见图1。

图1 各组大鼠海马组织形态（HE染色，×400）

2.3 锁阳黄酮对模型大鼠海马组织β淀粉样蛋白1-42表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织Aβ1-42表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和锁阳黄酮高剂量组大鼠海马组织Aβ1-42表达明显降低（P<0.05）。见图2、表3。

表3 各组大鼠海马组织Aβ1-42表达比较（±s，%）

表3 各组大鼠海马组织Aβ1-42表达比较（±s，%）

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，&P<0.05

组别空白组假手术组模型组多奈哌齐组锁阳黄酮低剂量组锁阳黄酮中剂量组锁阳黄酮高剂量组只数3 3 3 3 3 3 3阳性面积比0.21±0.05 0.32±0.01 11.72±1.34*3.44±0.79&8.93±1.81 6.97±0.63 5.14±0.54&

图2 各组大鼠海马组织Aβ1-42阳性表达（免疫组化染色，标尺=100 μm）

2.4 锁阳黄酮对模型大鼠海马组织和血清活性氧含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织和血清ROS含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，多奈哌齐组和锁阳黄酮高剂量组大鼠海马组织和血清ROS含量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表4。

表4 各组大鼠海马组织和血清ROS含量比较（±s，U/mL）

表4 各组大鼠海马组织和血清ROS含量比较（±s，U/mL）

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，&P<0.05，&&P<0.01

组别空白组假手术组模型组多奈哌齐组锁阳黄酮低剂量组锁阳黄酮中剂量组锁阳黄酮高剂量组海马组织只数6 6 6 6 6 6 6 ROS 17.09±3.87 15.74±6.03 33.30±7.62**23.35±5.49&&35.49±3.36 35.77±3.64 26.65±5.19&&血清只数10 10 10 10 10 10 10 ROS 20.40±2.82 20.06±6.44 37.37±7.25**22.88±8.22&31.11±4.93 29.34±7.15 26.19±4.17&&

2.5 锁阳黄酮对模型大鼠海马组织NADPH氧化酶各亚基和Nod样受体蛋白3、白细胞介素-1β蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织NADPH氧化酶各亚基和NLRP3、IL-1β蛋白表达升高（P<0.01）；与模型组比较，多奈哌齐组和锁阳黄酮高剂量组大鼠海马组织NADPH氧化酶各亚基和NLRP3、IL-1β蛋白表达降低（P<0.05，P<0.01）。见表5、图3。

表5 各组大鼠海马组织NADPH氧化酶各亚基和NLRP3、IL-1β蛋白表达比较（±s）

表5 各组大鼠海马组织NADPH氧化酶各亚基和NLRP3、IL-1β蛋白表达比较（±s）

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，&P<0.05，&&P<0.01

组别空白组假手术组模型组多奈哌齐组锁阳黄酮低剂量组锁阳黄酮中剂量组锁阳黄酮高剂量组只数3 3 3 3 3 3 3 gp91phox 1.00±0.00 1.03±0.21 8.71±0.96**2.16±0.46&&4.59±0.56&&2.93±0.29&&2.11±0.26&&p22phox 1.00±0.00 0.93±0.06 5.72±0.91**2.31±0.32&&4.01±0.14&&3.66±0.08&&2.22±0.33&&p47phox 1.00±0.00 1.08±0.11 3.29±0.18**1.44±0.18&&2.64±0.39&&2.01±0.26&&1.47±0.10&&p67phox 1.00±0.00 0.99±0.03 3.99±0.21**1.63±0.16&&3.09±0.51 2.60±0.51 1.65±0.15&&NLRP3 1.00±0.00 1.00±0.03 8.26±0.48**1.92±0.28&&6.45±0.46 3.25±0.32&&1.89±0.03&&IL-1β 1.00±0.00 1.06±0.10 4.29±0.30**2.06±0.02&3.67±0.42 2.85±0.21&2.09±0.05&

2.6 锁阳黄酮对模型大鼠海马组织NADPH氧化酶各亚基mRNA表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织NADPH氧化酶各亚基mRNA表达明显升高（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和锁阳黄酮高剂量组大鼠海马组织NADPH氧化酶各亚基mRNA表达明显降低（P<0.01，P<0.05）。见表6。

表6 各组大鼠海马组织NADPH氧化酶各亚基mRNA表达比较（±s）

表6 各组大鼠海马组织NADPH氧化酶各亚基mRNA表达比较（±s）

注：与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，&P<0.05，&&P<0.01

组别空白组假手术组模型组多奈哌齐组锁阳黄酮低剂量组锁阳黄酮中剂量组锁阳黄酮高剂量组只数3 3 3 3 3 3 3 gp91phox 1.00±0.04 0.83±0.09 13.01±1.78*2.28±0.16&9.62±0.21 4.90±0.21 2.31±0.06&p22phox 1.00±0.10 1.00±0.07 2.42±0.19**1.31±0.03&&1.96±0.17&&1.61±0.11&&1.49±0.07&&p47phox 1.02±0.25 0.38±0.03 12.15±0.78**2.00±0.13&&6.72±0.26&3.72±0.25&&2.39±0.10&&p67phox 1.00±0.04 0.60±0.10 9.46±0.67**1.73±0.15&&7.04±0.48 3.30±0.06&1.88±0.21&&

3 讨论

目前AD临床治疗包括心理、环境及药物干预等手段，临床效果有待进一步提高。中药及其有效部位能通过多通路、多靶点保护神经功能，疗效及安全性较好，如人参皂苷[14]、刺参多糖[15]、红景天苷[16]等是近年来AD防治领域的热点化合物。

氧化损伤和炎症反应是AD的关键致病因素。NADPH氧化酶与ROS生成密切相关，Aβ与小胶质细胞相互作用后可激活NADPH氧化酶，继而产生大量ROS，提示Aβ介导的NADPH氧化酶-ROS途径在AD过程中发挥重要作用。NADPH氧化酶活性主要通过膜亚基gp91phox、p22phox和胞浆亚基p47phox、p67phox表达量来反映，其中p47phox和p67phox在各种刺激引起的氧化应激反应中起始动性及枢纽性作用，而gp91phox和p22phox亚基是NADPH氧化酶蛋白家族的关键成员。本实验结果显示，模型组大鼠海马组织NADPH氧化酶亚基gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox蛋白和mRNA表达均明显上调，而经多奈哌齐和高剂量锁阳黄酮干预后，NADPH氧化酶各亚基蛋白和mRNA表达均明显降低，提示多奈哌齐和锁阳黄酮可通过抑制NADPH氧化酶各亚基表达降低ROS水平。目前，关于ROS介导NLRP3炎性小体活化的观点逐渐被认可[17]。研究显示，ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸可显著降低痴呆大鼠海马组织NLRP3和IL-1β蛋白水平[18]，表明ROS产生是促进NLRP3炎性小体激活的重要机制。本研究中，模型组大鼠海马组织和血清ROS含量均明显增加、海马组织NLRP3和IL-1β蛋白表达明显升高，锁阳黄酮高剂量组大鼠海马组织及血清ROS含量明显减少、海马组织NLRP3和IL-1β蛋白表达明显降低，提示其能通过抑制ROS产生，进而抑制NLRP3和IL-1β表达。

综上，锁阳黄酮可改善AD大鼠海马组织病理形态，下调ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表达，降低Aβ毒性，发挥神经保护作用。