TDP-43 在缺血性脑卒中的作用

李钇朋，闫文静，章帆，舒渝茜，何治*

(1 三峡大学国家中医药管理局中药药理科研三级实验室，宜昌 443002；2 三峡大学健康医学院，宜昌443002)

脑卒中是一种急性脑血管疾病，可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中以缺血性脑卒中为主，约占脑卒中的85%[1]。缺血性脑卒中一般由主要的大脑动脉严重狭窄或栓塞所致，特定大脑区域血流不足，在短时间内出现不可逆的组织损伤，并伴有脑水肿的快速发展，严重威胁患者身体健康[2]。

目前，治疗缺血性卒中的方法是溶栓治疗，由于重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator, r-tPA）的治疗窗口较窄（大约为缺血后3～4.5 h），且r-tPA 与脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤相关，导致其应用受限[3,4]。因此开发新的治疗方法对于减少脑缺血所带来的神经损伤至关重要。

反式激活应答DNA 结合蛋白43（transactive response DNA binding protein 43, TDP-43）是一种参与转录抑制和选择性剪接DNA 和RNA 的结合蛋白。TDP-43 在许多神经退行性疾病的中枢神经系统中，神经元和胶质细胞中的TDP-43 作为神经退行性疾病的病理学标记蛋白异常聚集和定位，可能成为治疗缺血性卒中的潜在靶点[5]。本文将对TDP-43 的蛋白结构、分布以及生理功能进行概述，并综述其TDP-在脑缺血发生发展中的作用。

1 TDP-43 的结构、分布与功能

TDP-43是一种由定位于人1号染色体Chrlp36.2上的TARDBP 基因编码的DNA/RNA 结合蛋白，在进化上高度保守，包含414 个氨基酸，相对分子量约为43kDa[6]。TDP-43 蛋白在结构上属于核内不均一核糖核蛋白细胞核因子家族，由一个N 末端、两个RNA 结合基序（RNA recognition motif, RRM）以及一个富含甘氨酸的C 端序列构成。其N 端对维持TDP-43 的正常构象和生物活性具有重要作用[7]，由1 个核定位信号（nuclear localization signal, NLS）、3个Caspase-3 识别位点以及一个核输出信号（nuclear export signal, NES）构成[8]。其中NES 和NLS 的突变是导致TDP-43 从胞核异常定位到胞质的主要原因。在应激条件下，TDP-43 蛋白还可被Caspase-3 切割为相对分子量为25kDa 和35kDa 大小的含C 末端的TDP-43 蛋白片段（C-terminal TDP-43 fragments,CTFs）。前者的异位表达导致细胞内TDP-43 包涵体形成，产生细胞毒性[9]。RRM 区域主要介导TDP-43与RNA 或者DNA 的结合[10]。TDP-43 蛋白C 端为甘氨酸富集区也被称为类朊蛋白结构域, 介导蛋白质之间的相互作用，而且该序列易于形成聚集体并可导致细胞毒性[11]。

TDP-43 蛋白在生理条件下广泛分布于人体和啮齿类动物的胎盘、脊髓、脾、睾丸、卵巢、胰腺、肺以及脑的细胞核中，在病理条件下形成不溶性泛素包合物，使TDP-43 从细胞核向细胞质的重新分布[12, 13]。

TDP-43 是一种具有多功能的核酸结合蛋白，能够通过多种途径调控RNA 的代谢、转录、剪接和翻译[14,15]。例如，研究发现，TDP-43 可通过调节神经元功能，在肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）、阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease, AD）、脑缺血等神经退行性疾病中扮演重要角色[16]。

2 TDP-43 在脑缺血中的作用

有研究表明，过表达TDP-43 的转基因小鼠在短暂性脑缺血后，其梗塞的面积与正常小鼠相比更大、神经元死亡数量也显著增加[17]。TDP-43 还参与缺血性脑卒中病理生理过程的系列反应，包括炎症、细胞凋亡、血脑屏障功能障碍、自噬、线粒体功能障碍、以及氧化应激等[17-19]。

2.1 TDP-43 在脑缺血发生后表达水平的改变

正常情况下TDP-43 主要分布在细胞核中，在病理条件下它可在细胞核与细胞质之间穿梭，以执行多种细胞功能[20]。在疾病或者应激状态下，病理性的TDP-43 可由基因突变以及磷酸化、泛素化和N末端截短等修饰过程所导致，如在应激条件下，胞质TDP-43 与一些蛋白质和RNAs 形成应激颗粒，由细胞核到细胞质再分布和聚集体，细胞质中TDP-43聚集体的持续积累，导致细胞核内游离的TDP-43 减少，进而反应性地促进TDP-43 生成加剧，而细胞质中TDP-43 的增加又干扰了细胞器的正常功能，最终导致细胞死亡[16]。

在大鼠大脑中动脉缺血90 min 再灌注1 d 后，缺血核心区以及半暗带全长的TDP-43 含量下降，但是分子量为25kDa 的TDP-43 的C 末端片段含量均升高。急性缺血性脑卒中后TDP-43 的亚细胞定位发生改变，可在胞质中检测到全长的TDP-43 以及其25kDa 片段，但该片段不能在胞核中检测到[21]。Kanazawa[21]等还发现，在急性缺血性脑卒中后，胞质TDP-43 再分布的神经元发生特异性泛素化，且呈现高比例细胞凋亡。在王锦[22]等研究中发现，大鼠缺血再灌注3 d 后， TDP-43 的表达急剧上升，大脑皮质、海马以及纹状体区域均出现聚集的颗粒样包涵体，其中皮质区域最明显，并且向细胞核外迁移，部分细胞的核周细胞质中也出现阳性反应物。

以上提示, 脑缺血的发生会诱导TDP-43 表达上调，并促进病理性TDP-43 聚集以及细胞质再分布，这种表达变化会进一步加重缺血性脑损伤。

2.2 TDP-43 参与脑缺血后炎症反应

过度的炎症和免疫反应是脑梗塞后缺血性脑损伤的病理生理基础[23]，脑缺血后各种炎性因子、趋化因子以及转录因子的产生，会引起神经元不可逆的损伤[24,25]。脑缺血后小胶质细胞激活，促进细胞碎片的清除及神经营养因子的分泌，修复受损的组织，但是小胶质细胞过度激活而释放的炎症物质会抑制中枢神经系统的修复，造成神经元的损伤[26]。

有研究表明，TDP-43 过表达的神经胶质细胞应激后导致肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β 等促炎因子增多[27]。小鼠脑缺血再灌注损伤模型中TDP-43 的上调增强了核因子κB 蛋白（nuclear factor kappa-B,NF-κB）介导的炎症和神经元损伤，而在给予NF-κB抑制剂后能有效改善TDP-43 所导致的神经元炎性损伤[17]。这提示TDP-43 过表达可促进炎症反应的发生，损伤神经细胞，进一步加重缺血性脑损伤。

2.3 TDP-43 介导线粒体功能障碍

线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，它通过氧化磷酸化供给细胞能量[28]。卒中后神经元因缺血缺氧损伤线粒体，进而干扰磷酸化过程和三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）的供应导致神经元可塑性降低[29]，并且线粒体功能障碍还与脑缺血中氧化应激、凋亡等的发生机制密切相关[30]。TDP-43 的突变、过表达以及在线粒体中的异常积累会导致线粒体形态异常、功能障碍以及融合分裂动力学异常，从而损害细胞能量供应，最终导致神经元损伤[31]。

Wang 等[32]研究发现在TDP-43 转基因小鼠中，细胞质中TDP-43 的异常定位导致其在线粒体的蓄积并引发线粒体功能障碍，而在使用一种TDP-43 线粒体定位抑制酶后，胞质中TDP-43 的异常聚集被清除，线粒体功能得以恢复，并且改善了转基因小鼠的认知缺陷和运动协调。同时在体外实验，糖氧剥夺/复氧复糖（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）的星形胶质细胞给予人参皂苷Rg1 后，线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅴ的活性增强，并提高了ATP 的水平。提示人参皂苷可能通过促进线粒体氧化磷酸化来改善线粒体功能，减轻OGD/R 之后星形胶质细胞的损伤[33]。

由此可以推断，细胞质中TDP-43 的异常表达可引起线粒体功能障碍，减少能量供给，导致神经元细胞受损，加重脑缺血后脑损伤。

2.4 TDP-43 调节自噬

自噬是一种代谢机制，指细胞在自噬相关基因调控下通过溶酶体囊泡结构降解细胞内物质，这一过程能够避免错误折叠蛋白质的积累[34]。有研究证实，受损的线粒体、蛋白质、以及过氧化物酶体和病原体可以通过自噬选择性降解，从而保护细胞出现代谢应激防止细胞氧化损伤，而自噬对维持体内平衡至关重要[35,36]。

有研究表明，TDP-43 可通过增加自噬相关蛋白7、雷帕霉素靶蛋白相关调节蛋白和动力蛋白激活蛋白的稳定性来调节自噬。并且当TDP-43 浓度降低后，这些自噬相关蛋白mRNA 的浓度也明显降低[19,37]。

在脑缺血损伤后，自噬对神经元起着双重作用[38]。一方面，3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）可抑制自噬通路的激活，加剧神经元的凋亡和坏死，增加大鼠缺血缺氧所致的脑梗塞体积和神经功能损伤；另一方面在脑缺血前激活自噬通路可以增加蛋白激酶B（protein kinase B, PK）和环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein, CREB）的磷酸化，从而显著减少神经元死亡和脑损伤[39]。然而在自噬阻断剂3-MA 的干预下，突变型TDP-43 及TDP43-CTFs25、TDP43-CTFs35的表达水平均增高，从反面证实了突变型TDP-43 及其C 末端截短片段可通过自噬通路降解。因此，抑制缺血后自噬可以增加TDP-43 及其C 末端截短片段TDP43-CTFs25、TDP43-CTFs35 聚集物的加剧累积，增强细胞应激并诱导细胞死亡[40]。

2.5 TDP-43 促进细胞凋亡

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，在缺血时神经细胞凋亡是I/R 损伤最常见的形式之一[41]，可诱导产生氧自由基，导致细胞死亡。有研究表明，细胞凋亡会导致组织血流量减少，导致细胞发生形态、生化和行为变化等[42-44]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）为MAPK 家族蛋白的重要一员，介导对外界应激信号做出反应的基本生物过程，具有调节细胞转移、凋亡、增殖和分化的作用，可以在各种应激刺激下激活，并通过作用于下游靶点，如转录因子以及抗凋亡蛋白B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）并介导其多种功能[45]。

有研究表明当JNK 通路被激活时，其下游凋亡相关靶基因的转录与表达受到调控，引发细胞的凋亡[46]。磷酸化的JNK（P-hosphorylation-c-Jun n-terminal kinase, p-JNK）作为JNK 的活性形式，有研究表明脑缺血后p-JNK 的表达增强，表明脑缺血能够通过JNK 信号通路激活细胞凋亡途径并介导神经元的损伤，引发神经退变的过程[30]。在神经元细胞中上调Ubiquilin-2 蛋白可以激活JNK 和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK）增强NF-κB 活化使TDP-43 聚集[47]。另有报道，TDP-43 的过表达可以抑制JNK 和p38 的激活[48]。脑缺血后激活p-JNK 和磷酸化p38（P-hosphorylation-p38 MAPK, p-p38 MAPK）通路，使TDP-43 表达升高，而TDP-43 的过表达又反作用于p-JNK 和p-p38，降低其表达水平，使之呈现一种负反馈调节，最终加剧神经细胞死亡与神经退行性病变的发生[30]。

由此提示，TDP-43 可通过JNK 信号通路，加剧细胞凋亡，引起神经元凋亡和神经退行性病变的发生。

2.6 血脑屏障功能障碍

血脑屏障是由脑微血管内皮细胞和紧密连接蛋白、细胞外基质、神经元、周细胞以及星形胶质细胞等通过相互作用形成的一种动态屏障[49]。有研究表明，I/R 后血脑屏障被破坏，导致大量大分子、血细胞等进入脑实质进一步加重脑损伤引起神经功能损害[50]。

Yes 相关蛋白（YES-associated protein, YAP）作为Hippo 信号通路的转录激活因子可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成，调节紧密连接蛋白的生成与完整性[51-53]。脑血管内皮细胞的紧密连接蛋白，包括密封蛋白和闭合蛋白，是调节血脑屏障完整性和通透性的主要结构[54,55]。有研究表明，在小鼠MACO 模型和体外原代脑内皮细胞OGD/R 实验中，沉默全长的TDP-43 或者过表达TDP43-CTFs35可导致细胞质中磷酸化的YAP（Phosphorylation YES-associated protein, p-YAP）与紧密连接蛋白含量降低，进而抑制血管内皮细胞迁移[56]。由此可以推断，TDP-43 和TDP43-CTFs35 通过Hippo-YAP 信号通路来调节血管内皮细胞的功能，诱导脑内皮细胞紧密连接蛋白和p-YAP 的水平降低，抑制血管内皮细胞迁移导致血脑屏障功能障碍，阻碍脑缺血后神经元修复[56,57]。

3 TDP-43 在脑缺血相关疾病中的作用

TDP-43 除了通过介导炎症、细胞凋亡、血脑屏障功能障碍、自噬、线粒体功能障碍、以及氧化应激等过程对缺血性脑卒中发挥神经保护作用外，还血管性痴呆、脑缺血后继发性脊髓损伤等脑缺血相关疾病中发挥重要作用。

3.1 血管性痴呆

血管性痴呆是因大脑血流受阻而致脑细胞缺氧或缺少营养物质供给，最终导致患者出现认知功能障碍的一种疾病。缺血性脑卒中患者往往累及大脑微动脉和微循环，引起血管管壁增厚和管腔狭窄，甚至血管栓塞，血流阻力大，组织供血、供氧不足，导致神经元受损，出现认知功能障碍，促进血管性痴呆的发展[58]。

Thammisetty[59]等研究发现，当闭塞小鼠单侧颈总动脉引起慢性脑缺血（chronic cerebral hypoperfusion, CCH）会诱导TDP-43 的胞质定位异常和不溶性磷酸化TDP-43 聚集物的形成，活化小胶质细胞，激活炎症反应，使细胞代谢紊乱，神经元受损，进而发展成为认知缺陷和运动障碍。提示TDP-43 可以加重血管性痴呆并与血管性痴呆的发生发展密切相关。

3.2 脑缺血继发性脊髓损伤

脊髓损伤是通过直接损伤脊髓实质和相关的脊髓神经造成感觉、运动功能障碍和肌张力异常等[60]。脑缺血后，由于皮质、海马及纹状体神经元受损，其向脊髓传递信号发生异常变化，致使脊髓中胶质细胞激活、炎性因子表达水平升高等继发性神经炎性反应，可直接或间接地损伤前角运动神经元，加上前角运动神经元受上级神经直接调控的异常影响，进一步加深了神经元的损伤[16]。

孙潇[16]等人发现，大鼠脑缺血后脊髓前角运动神经元中出现TDP-43 含量增加且出现从细胞核到细胞质异位的现象，三七皂苷Rg1 可以缓解脑缺血所致的脊髓继发性神经退变和降低炎症反应，进而对脑缺血所引起的脊髓损伤产生保护作用。

4 结语与展望

综上所述，脑缺血的发生会导致TDP-43 表达以及结构和定位的变化，可能参与脑缺血损伤的病理生理过程, 包括氧化应激、血脑屏障功能障碍、细胞凋亡、线粒体功能障碍、自噬和炎症等。有研究表明，通过降低TDP-43 的表达可以有效缓解脑缺血所致的神经损伤。关于具体哪种药物可以降低TDP-43的表达研究相对较少，目前已有的报道仅有人参皂苷Rg1 和三七皂苷Rg1[16,30]。因此，TDP-43 作为一个潜在的靶点, 为缺血性中风的治疗提供了新可能性，也为临床新药物的研发提供了理论依据。后续的研究重点应该集中于是否能将TDP-43 作为治疗脑缺血的新靶点，寻找可以降低TDP-43 表达水平的具体物质。另一方面，也可以探讨将TDP-43 作为标志物，开发新的关于脑缺血相关疾病的检测手段。