2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC分析方法建立及优化中的几点思考

王 娟，范婷婷，刘丰茂

(中国农业大学理学院，北京 100193)

1 前言

2-(乙酰氧基)苯甲酸(Acetylsalicylic acid，ASA)又称阿司匹林，乙酰水杨酸，是一种广泛用于农业中的植物生长调节剂[1]。外源施用能够有效减轻活性氧对植物叶面细胞膜的伤害，使细胞膜结构的稳定性得到保护，有效地调节植物叶面毛孔关闭抑制叶片水分蒸腾，延续作物衰老，具有细胞激活、抗旱、助长、抗病作用[2-5]。目前已经建立了2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC-MS[1，6]分析方法，虽然方法灵敏度很高，但不适合用于农药产品的定量分析；此外，还报道了通过分光光度法[7]和化学滴定法[8]快速地测定药片中2-(乙酰氧基)苯甲酸的含量，但结果会产生较大误差。有研究也建立了2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC法，操作简单、应用范围广[9-10]，检测结果能达到农药产品定量分析的检测要求，但在研究中并未对其在分析过程中易分解成水杨酸的问题进行探讨并对分析条件进行优化。

本文针对已登记的产品，建立了有效成分2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC相分析方法，探讨了其在分析过程中易分解成水杨酸的问题，还通过对溶解溶剂、流动相、洗脱方式及特异性参数进行了方法优化，并对99%原药及30%可溶粉剂进行了分析。最终所建立方法具有快速、稳定、分离效果好、应用范围广等特点，符合农药产品定量分析的检测要求，为农药产品标准分析方法的建立提供依据。

2 实验部分

2.1 试剂 甲醇(色谱纯)，冰乙酸，氯化钾(分析纯)；水：新蒸二次蒸馏水或超纯水；2-(乙酰氧基)苯甲酸原药(99%)和标样(ω≥99.8%)，水杨酸标样(ω≥99.8%)；2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉剂(30%)。

2.2 仪器 高效液相色谱仪：Agilent1260，具有可变波长紫外检测器；Agilent色谱工作站；色谱柱：250 mm×4.6 mm(i.d.)不锈钢柱，内装Innoval C18、5 μm填充物；微量进样器：50 μL；定量进样管：5 μL。

2.3 色谱操作条件 流动相：Ψ(甲醇∶0.1%冰乙酸溶液)=45∶55；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：276 nm；进样体积：5 μL；保留时间：2-(乙酰氧基)苯甲酸约6.6 min。典型的2-(乙酰氧基)苯甲酸标样和样品色谱图(图1～3)。

图1 2-(乙酰氧基)苯甲酸标准品HPLC图

2.4 测定步骤

2.4.1 标样溶液配制 称取0.02 g(精确至0.000 01 g)2-(乙酰氧基)苯甲酸标样于25 mL容量瓶中，加入适量1%冰乙酸甲醇溶液，超声5 min，冷却至室温，用1%冰乙酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀备用。

图2 99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原药的HPLC图

图3 30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉剂的HPLC图

2.4.2 试样溶液的配制 称取0.02 g(精确至0.000 01 g)2-(乙酰氧基)苯甲酸试样于25 mL容量瓶中，加入适量1%冰乙酸甲醇溶液，超声5 min，冷却至室温，用1%冰乙酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀备用。

2.4.3 测定 在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面积相对变化<1.2%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

高温对体外唾液链球菌clpP基因表达的影响 … ……………………………… 朱铭慧，等(12):1396

2.4.4 计算 将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面积分别进行平均。试样中2-(乙酰氧基)苯甲酸质量分数按以下公式计算：

式中：

ω1—试样中2-(乙酰氧基)苯甲酸的质量分数，%；

A2—试样溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面积的平均值；

m1—2-(乙酰氧基)苯甲酸标样的质量，g；

ω—标样中2-(乙酰氧基)苯甲酸的质量分数，%；

A1—标样溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸峰面积的平均值；

m2—试样的质量，g。

3 结果与讨论

3.1 检测波长的选择 2-(乙酰氧基)苯甲酸的紫外光谱图(图4)，从图中可以看到在190～400 nm范围内，2-(乙酰氧基)苯甲酸在235 nm和276 nm处有紫外特征吸收峰。由于235 nm近紫外末端，干扰较大，为减少干扰，因此本方法将检测波长确定为276 nm，这也与前期研究报道的检测波长一致[11]。

图4 2-(乙酰氧基)苯甲酸的紫外光谱图

3.2 溶解溶剂的选择 因2-(乙酰氧基)苯甲酸苯环上的乙酰基容易水解成水杨酸和乙酸(图5)，本研究比较了不同溶剂(甲醇和1%冰乙酸甲醇)溶解2-(乙酰氧基)苯甲酸产品时的效果。当使用纯甲醇溶解2-(乙酰氧基)苯甲酸产品时，部分2-(乙酰氧基)苯甲酸会发生分解，产生水杨酸(图5)，在以往的文献中也有相似的报道[8]。

图5 2-(乙酰氧基)苯甲酸水解产生水杨酸和乙酸反应式

当在溶剂中加入适量乙酸，使用1%冰乙酸甲醇溶解时，能有效抑制2-(乙酰氧基)苯甲酸分解成水杨酸，有效成分会更稳定(图6)。因此本方法选择1%冰乙酸甲醇作为溶解2-(乙酰氧基)苯甲酸农药产品的溶剂。

图6 甲醇溶解(左)、1%冰乙酸甲醇溶解(右)色谱图(峰1—2-(乙酰氧基)苯甲酸；峰2—水杨酸)

3.3 流动相、洗脱方式的选择 为了得到更好的分离效果和峰形，本研究比较了不同流动相及洗脱方式对有效成分色谱峰的影响，流动相采用甲醇/水、甲醇/0.1%冰乙酸水溶液(pH=3.3)。

结果表明，当流动相中不加入冰乙酸时，会出现明显的水杨酸峰(图7A)，说明目标化合物水解严重；当在流动相中加了0.1%冰乙酸后，水解受到抑制，稳定了2-(乙酰氧基)苯甲酸(图7B、C)。

在对比等度洗脱和梯度洗脱效果时发现，当使用梯度洗脱时，洗脱程序(表1)，有效成分的色谱峰峰型更好，峰宽更窄(图7B)；而使用甲醇：0.1%冰乙酸溶液进行等度洗脱时，有效成分的色谱峰峰型偏宽(图7C)。从仪器设备角度考虑，梯度洗脱更复杂，对仪器设备要求更高。将流动相按不同比例在色谱柱上进行试验，随着甲醇比例减少，杂质水杨酸出峰时间越晚，运行时间延长，最终选择甲醇∶0.1%冰乙酸溶液(V/V，45∶55)作为流动相。该条件下，2-(乙酰氧基)苯甲酸色谱峰峰形较好，与杂质能完全分离，并且分析时间较短，提高了工作效率。

图7 不同流动相洗脱色谱图A：甲醇：水等度洗脱、B：甲醇：0.1%冰乙酸溶液梯度洗脱、C：甲醇：0.1%冰乙酸溶液45∶55等度洗脱

3.4 特异性实验 本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别2-(乙酰氧基)苯甲酸。实验结果发现因有效成分2-(乙酰氧基)苯甲酸在235 nm有吸收，流动相中又含有乙酸，其截止波长为230 nm。因此在采用梯度洗脱时，乙酸含量变化会影响方法特异性，计算特异性的起始波长选取对峰吸收纯度干扰很大(表2)，起始波长达到240 nm，特异性才合格。而当选择等度洗脱时，乙酸含量是恒定的，干扰因素大大降低，计算特异性的起始波长选取对对峰吸收纯度影响较小，起始波长在200 nm以上特异性就合格。因此当采用梯度洗脱时，应注意选取高于溶剂截止波长的起始波长进行特异性参数确认。而采取等度洗脱时未发现溶剂截止波长对特异性的影响，因此本方法洗脱方式最终选择等度洗脱。

表2 梯度洗脱时不同起始波长对纯度因子的影响

图8 2-(乙酰氧基)苯甲酸标样HPLC-DAD峰纯度色谱图

3.5 分析方法的线性相关性试验 按标样溶液制备方法配制(201.6～2016.0 mg/L)5个不同浓度的有效成分线性相关溶液，测定每个溶液中2-(乙酰氧基)苯甲酸的峰面积，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果，2-(乙酰氧基)苯甲酸质量浓度在201.6～2 016.0 mg/L之间与相应的峰面积之间呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=1.756 86x+23.487 31，R=0.999 8，可以满足定量分析要求。

3.6 分析方法的精密度试验 按2.5.2试样溶液的制备方法配制5个99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原药的精密度溶液，和5个30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉剂的精密度溶液，进行测定，测得99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原药和30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉剂标准偏差分别为0.49%和1.42%，变异系数分别为0.49%和1.42%，结果表明(表3)该分析方法具有良好的重现性、良好的精密度。

表3 虱螨脲(氯虫苯甲酰胺)的线性相关性试验数据

表3 2-(乙酰氧基)苯甲酸精密度试验结果

3.7 方法准确度实验 称取0.01 g(精确至0.000 01 g)2-(乙酰氧基)苯甲酸的30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉剂于25 mL容量瓶中，再加入2-(乙酰氧基)苯甲酸标样0.01 g(精确至0.000 01 g)，按2.5.2试样溶液的制备方法配制5个30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉剂的准确度溶液进行测定。

实验结果可知，按所建立的方法进行HPLC测定，其添加回收率在98.21%～99.33%范围内(表4)，符合农药产品定量分析的检测要求。

4 结论

本文建立了2-(乙酰氧基)苯甲酸的HPLC分析方法，并对溶剂对样品的稳定性影响，梯度或等度洗脱的差异，以及特异性参数设置对纯度因子的影响进行了研究，得出以下几条结论：

(1)2-(乙酰氧基)苯甲酸易分解为水杨酸和乙酸，因此在溶解此类产品时，在溶剂中加入一定量的冰乙酸，同时在流动相中也加入冰乙酸，都能有效抑制其分解，能在产品定量分析时提高准确度。

(2)在对2-(乙酰氧基)苯甲酸进行梯度洗脱时，能产生比等度洗脱峰形更好、峰宽更窄的色谱峰，但梯度洗脱更复杂，对仪器设备要求更高。此外，在进行梯度洗脱时，乙酸含量变化会影响方法特异性，需选取高于溶剂截止波长的起始波长进行特异性参数确认；因此推荐选用等度洗脱。

(3)方法以甲醇∶0.1%冰乙酸溶液(V/V，45∶55)为流动相，等度洗脱，使用Innoval C18色谱柱和二极管阵列检测器，在276 nm的检测波长下，对99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原药及30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉剂进行分析。方法确证结果表明，该分析方法条件下的2-(乙酰氧基)苯甲酸的线性相关系数为0.999 8，99% 2-(乙酰氧基)苯甲酸原药及30% 2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶粉剂变异系数分别为0.49%和1.42%，30%2-(乙酰氧基)苯甲酸可溶性粉剂的平均回收率分别为98.58%。此方法快速、灵敏，具有良好的线性关系、准确度和精密度，是2-(乙酰氧基)苯甲酸产品质量控制的有效可行的分析方法。