基于网络药理学和分子对接技术的三七总皂苷治疗糖尿病足作用机制分析

李元超，王佳荣，朱虹颖，王建波

上海交通大学医学院附属第六人民医院介入放射科，上海 200233

糖尿病足是指糖尿病患者足部皮肤表现为难以愈合的溃疡，是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，如果没有得到及时治疗，可导致足部和腿部截肢，甚至危及生命。据统计，19% ～ 34%的糖尿病患者会经历足部溃疡［1］，而截肢的糖尿病足患者5年病死率在40% ～ 50%［2-3］。寻找能够有效促进糖尿病足愈合的治疗方法具有十分重要的意义。中医药可通过多靶点、多途径预防和治疗糖尿病足。三七总皂苷（PNS）为达玛烷型的四环三萜类化合物，是中草药三七的主要提取物。PNS主要应用于治疗心脑血管疾病的治疗，如脑梗死、冠心病心绞痛等。大量临床试验显示，PNS 对糖尿病足也有良好的治疗效果［4-8］，但是作用机制尚不明确。2022 年2 月—12月，本研究采用网络药理学方法和分子对接技术，探索PNS 治疗糖尿病足的相关作用机制和靶点，为PNS在糖尿病足治疗中的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 PNS 活性成分及相关靶点的筛选 通过Symmap 数据库（www. symmap. org/）检索PNS 活性成分，结合《中华人民共和国药典》（2020 版）和相关文献［9-10］，确定PNS的主要活性成分。利用本草组鉴数据 库（http://herb.ac.cn/）及PharmMapper 平 台（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php）收集活性成分的相关靶点。

1.2 糖尿病足疾病相关靶点的筛选 基于Gene-Cards 数据库（https://www.genecards.org/）、比较毒理基因组学数据库（CTD，http://ctdbase.org/），使用关键词“diabetic foot”筛选糖尿病足的相关靶点。由于CTD 和GeneCards 数据库相关靶点过多，分别以CTD 检索结果中“inference score”＞7.38（两倍中位数）、GeneCards 检索结果中“relevance score”＞4.36（两倍中位数）为标准筛选靶点［11］，确保筛选靶点的全面性与准确性。

1.3 PNS 与糖尿病足共同靶点核心基因筛选 根据“1.1”“1.2”，将PNS 与糖尿病足的共同靶点导入STRING 数据库（https://string-db.org/），构建PNS与糖尿病足的共同靶点蛋白的蛋白质相互作用（PPI）网络。物种选择为“Homo sapiens”，置信水平设置为≥0.4。导出PPI 网络图并下载tsv 格式文件进一步分析。采用Cytoscape3.9.1 软件中的Cyto-Hubba插件进一步对PPI网络进行拓扑分析，以最大团中心性值（MCC）前10位的基因为核心基因。

1.4 PNS 与糖尿病足共同靶点的功能分析 采用R4.1.2 软件中的“Clusterprofiler”包（4.2.2 版）对PNS 与糖尿病足的共同靶点进行基因本体论（GO）及京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。物种类型设置为“Homo sapiens”，校正P＜0.05 为差异有统计学意义。使用“ggplot2”包（3.35 版）对GO 分析与KEGG 分析显著富集的结果分别绘制气泡图。

1.5 PNS 治疗糖尿病足的核心成分及核心靶点筛选 利用Cytoscape 软件构建由PNS 活性成分、PNS与糖尿病足共同靶点和显著富集通路组成的成分—靶点—通路网络。在网络中，使用不同形状和颜色的节点表示不同类型的元素，连线表示不同节点之间存在联系。通过Cytoscape 插件“CytoHubba”对该网络进行拓扑分析，计算各节点的拓扑学参数，并以MCC 值筛选PNS 治疗糖尿病足的核心成分与核心靶点。

1.6 PNS 活性成分与核心靶点的分子对接验证 利用分子对接技术验证PNS活性成分与核心靶点之间的结合能力。分子对接软件为采用半柔性对接方式的Auto Dock Vina。各靶点的蛋白晶体结构从PDB 数据库（http://www. rcsb. org/）下载，选择的3D 结构必须符合物种类型为“Homo sapiens”、高分辨率（＜3.0Å）并含有原始配体。利用Pymol 软件去除各蛋白的配体及水分子。通过PubChem 数据库获得PNS 活性成分的结构文件。对接前使用Auto Dock Tools 预处理受体与配体，设置对接盒子，其范围要覆盖整个蛋白受体结构，确保包括任何可能的停靠口袋，最后使用Auto Dock Vina 执行对接。通过PyMOL 和Discovery studio4.5 软件对具有代表性的对接结果进行可视化。统计每对复合物之间的最低结合能，以评估PNS 各成分与靶蛋白之间的结合稳定性。结合能＜-5 kcal/mol 表示结合活性良好，数值越低则代表结合能力越强。

2 结果

2.1 PNS活性成分及作用靶点 PNS的主要入血活性成分为三七皂苷R1（PubChem CID：441934）、人参皂苷Rb1（PubChem CID：9898279）、人参皂苷Rd（PubChem CID：24721561）、人参皂苷Re（PubChem CID：441921）和 人 参 皂 苷Rg1（PubChem CID：441923）。筛选得到5种活性成分的靶点基因349个。

2.2 糖尿病足疾病相关靶点 共收集343 个糖尿病足相关靶点（见OSID 码图1），最终确定56 个PNS和糖尿病足的共同靶点，包括血管内皮生长因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白细胞介素（IL）1β、基质金属蛋白酶9（MMP9）、表皮生长因子受体（EGFR）、纤粘蛋白（FN1）、丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、细胞信号转导分子2（SMAD2）、转化蛋白p21（HRAS）、转化蛋白RhoA（RHOA）、胰岛素样生长因子1（IGF1）、转化生长因子β1、一氧化氮合成酶3（NOS3）、c-Fos 蛋白、MMP2、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）14、膜联蛋白A5、纤溶酶原激活物抑制物1、MAPK8、IGF1 受体、NF-κB 抑制剂α、信号转导及转录激活因子1、IL-4、血管黏附蛋白1、趋化因子配体5、转化生长因子β 受体1、蛋白质酪氨酸激酶、选择素E、过氧化物酶体增殖物激活受体α、一氧化氮合成酶2、血管生成素1 受体、二肽基肽酶4、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1、脂质运载蛋白2、超氧化物歧化酶2、磷酸化蛋白激酶Cβ 、葡萄糖转运蛋白4、死骨片1-泛素结合蛋白、维生素D3受体、蛋白激酶A催化亚基α、成纤维细胞生长因子受体1、Ras 相关C3肉毒素底物1、组织型纤溶酶原激活物、组织蛋白酶K、微管相关蛋白Tau、醛糖还原酶、胰岛素受体、谷胱甘肽还原酶、抗凋亡蛋白BCL-2、谷胱甘肽硫转移酶P1、3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、己糖激酶1、脑啡肽酶、线粒体乙醛脱氢酶、山梨醇脱氢酶、转甲状腺素蛋白。

2.3 PNS 与糖尿病足共同靶点核心基因 将56 个共同靶点导入到STRING 数据库中，构建PPI 网络（OSID 码图2），包括56 个节点和594 个连线。MCC值排名前10 的靶点（核心靶点）为VEGFA、CASP3、IL-1β、MMP9、EGFR、FN1、AKT1、SMAD2、HRAS、RHOA（OSID码图3）。

2.4 PNS 与糖尿病足共同靶点的GO 和KEGG 分析结果 GO 富集分析得到582 条GO 条目，其中生物过程464条、分子功能82条、细胞组分36条；以校正P值从小到大排序，分别选取前20 个条目进行可视化（见OSID 码图4a～c）；PNS 治疗糖尿病足的生物过程主要涉及伤口愈合、氧化应激应答、炎症反应调节、肌细胞增殖、上皮细胞迁移及神经元死亡的调节，细胞成分主要富集于膜筏、囊腔、分泌颗粒腔、血小板α颗粒腔、细胞质囊泡腔，分子功能主要富集于磷酸酶结合、细胞因子受体结合、跨膜受体蛋白激酶活性、蛋白酶结合等。KEGG 通路富集分析共得到159 条信号通路，主要涉及糖尿病并发症中的AGERAGE 信号通路、MAPK 信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路、HIF-1 信号通路、PI3K/AKT 信号通路、FoxO 信号通路、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、VEGF 信号通路等。选取与糖尿病足相关的20条显著富集通路进行可视化，见OSID码图4d。

2.5 PNS 治疗糖尿病足的核心成分及核心靶点构建的成分—靶点—通路网络图（OSID码图5）包括81 个节点和420 条边。MCC 值排名前10 的靶点分别为AKT1、HRAS、MAPK14、MAPK8、EGFR、IGF1、RAC1、BCL2、NOS3和MMP9（OSID码图6）。

2.6 PNS 活性成分与核心靶点的分子对接模拟情况 PPI 网络及成分—靶点—通路网络的拓扑分析结果显示，AKT1、MMP9、EGFR、HRAS 在两个网络中处于最核心的位置（MCC值前10位），选择以上靶基因编码蛋白分别与其相应的PNS活性成分进行分子对接，结果显示，AKT1 与三七皂苷R1 结合能为-8.9 kcal/mol，EGFR 与人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re 和人参皂苷Rg1 的结合能分别为-8.3、-7.9、-7.4、-7.0 kcal/mol，MMP9 与人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1 和三七皂苷R1 的结合能分别为-7.3、-8.6、-8.3、-7.8、-7.4 kcal/mol，HRAS 与人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re 和人参皂苷Rg1 结合能分别为-6.9、-6.7、-6.4、-6.7 kcal/mol。4 个靶点与PNS活性成分结合能均＜-5 kcal/mol，表明它们能够稳定结合，AKT1、MMP9、EGFR、HRAS 可能是PNS 治疗糖尿病足的主要作用靶点。见OSID码图7。

3 讨论

糖尿病足是糖尿病的严重慢性并发症，可能导致截肢甚至危及生命。随着对糖尿病足的不断研究与认识，西医开发了多种方法促进溃疡愈合，包括血管介入治疗［12］、创面负压吸引［13］、高压氧疗［14］、干细胞移植术治疗［15］、胫骨横向搬移术［16］等，然而，各种方法都有其局限性。中医药治疗糖尿病足具有悠久的历史，疗效确切。多项临床研究显示，PNS治疗糖尿病足疗效显著。研究表明，PNS 可通过抑制炎症因子释放、扩张血管、促进血管生成、促进成纤维细胞增殖、清除自由基、抗氧化等作用，有效改善糖尿病足患者临床指标，促进足部溃疡伤口修复［4，7-8，17］。

本研究基于网络药理学预测PNS治疗糖尿病足的靶点，结果显示PNS 治疗糖尿病足的核心靶点主要为AKT1、HRAS、EGFR、MMP9。经分子对接模拟验证，上述4个靶点和PNS的5个活性成分之间均能稳定结合，提示PNS 可能主要通过这4 个靶点发挥治疗糖尿病足的作用。EGFR 主要在上皮细胞中表达，主要功能是促进细胞生长、迁移和存活。EGFR可以通过调节内皮细胞增殖、凋亡和迁移来影响血管生成，在促进血管生成中发挥重要作用。血管生成受损是糖尿病的标志性病理表现，也是糖尿病足溃疡经久不愈的关键原因。近期研究表明，EGFR表达下调是糖尿病足溃疡进展的重要因素［18］。AKT1 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，位于PI3K/AKT 信号通路的核心部位，不仅能够调节细胞增殖、凋亡和血管生成等关键过程，同时可调节葡萄糖的摄取［19］。研究表明，PI3K/AKT 信号通路可调节胰岛素水平，该通路激活有助于纠正胰岛素抵抗［20］。MMP9 属于MMP 基因家族，在组织血管生成、重塑及修复中起重要作用。研究发现，MMP9 可促进糖尿病溃疡大鼠的创面愈合［21-22］。HRAS 是RAS 家族的主要成员之一，参与RAS 蛋白信号转导的活化，负责调控细胞增殖、存活、分化和转录等基本生理功能［23］。

GO 分析结果显示，PNS 治疗糖尿病足主要通过伤口修复、对脂多糖的反应、对氧化应激的反应、平滑肌细胞增殖的调节、细胞间黏附的调节、神经元死亡调节、上皮细胞迁移等生物过程发挥作用。KEGG 通路富集分析结果显示，PNS 通过调控糖尿病并发症AGE-RAGE 信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路、PI3K-AKT 信号通路、HIF-1 信号通路、Toll样受体信号通路、Fox O 信号通路、TNF 信号通路等多种途径促进溃疡伤口愈合，从而治疗糖尿病足。AGE-RAGE 信号通路是糖尿病足愈合过程中十分重要的通路。糖尿病患者体内血糖持续升高，导致过多的AGEs 生成，使AGE-RAGE 信号通路激活，进一步启动NF-κB信号通路，引发炎症反应；同时也会激活VEGF 信号通路，增加血管通透性，导致糖尿病足创面形成并影响愈合［24］。PI3K-AKT 可调控胰岛β 细胞，纠正体内代谢异常，如抗胰岛β 细胞凋亡、促进胰岛β 细胞增殖及减轻胰岛素抵抗等［25-26］。如果在糖尿病神经元中抑制PI3K-AKT 信号通路，可导致神经元凋亡增加，并诱导糖尿病神经病理性疼痛的发生。PI3K-AKT 通路的激活可以缓解疼痛性糖尿病周围神经病变［27］。此外，PI3K-AKT信号通路激活还可上调HIF-1 表达，加速伤口细胞增殖、促进愈合［28-29］。相关动物实验表明，HIF-1 信号通路一定程度上会影响VEGF 的表达，促进血管新生；其也可能通过促进成纤维细胞增殖，增加胶原蛋白生成，加速糖尿病足小鼠创面愈合［30］。脂质与动脉粥样硬化通路也与糖尿病足关系密切。下肢中小动脉粥样硬化引起管腔狭窄、血栓形成乃至血管闭塞，将导致远端肢体缺血缺氧，是糖尿病足的发生发展的重要机制［31］。研究表明，PNS具有抗动脉粥样硬化作用，主要通过抗炎和调节血脂来实现。

综上所述，PNS 能通过多成分、多靶点、多通路协同作用，干预糖尿病足发生发展的多个环节。PNS 活性成分通过靶向调控AKT1、MMP9、EGFR、HRAS 等关键靶点，发挥促进上皮细胞增殖、调节炎症反应、抗氧化反应、促血管生成、抗神经元细胞死亡等作用，从而达到治疗糖尿病足的效果，其核心通路主要涉及糖尿病并发症AGE-RAGE 信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路、PI3K-AKT 信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK 信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等。上述结果为进一步探讨PNS的作用机制提供了方向，也为系统开展PNS 各单体治疗糖尿病足的基础和临床研究提供了理论依据。