外泌体与糖尿病肾病发病、治疗研究进展

潘 璐，陈丽名，谷浩荣 综述 李小会 审校

外泌体(exosome)在1982年作为一类由细胞分泌到胞外的囊泡被Pan和Johnstone初次被发现，他们在跟踪绵羊网状细胞成熟过程时，发觉有一种囊泡与转铁蛋白受体释放到细胞外空间有关，此类小泡被命名为外泌体[1]。但外泌体被发现之后十几年的历程中，一直被认为是细胞产生的“垃圾”，它的生物学作用没有引起研究者的重视。直到1996年，有科学家发现B淋巴细胞能分泌抗原提呈的外泌体携带有共刺激因子、MHC-II类分子和黏附因子，此类外泌体能够直接刺激效应CD4阳性的细胞产生抗肿瘤效应[2]。自此之后，研究人员发现，外泌体中包含有DNA片段、mRNA、微小RNA、功能蛋白、转录因子等多种具有生物活性的物质，而其本身的膜结构还能表达多种抗原、抗体分子，从而产生生物学效应[3]。至此，一个在自然界默默传输关键生物信息的“快递员”慢慢浮出了水面。本文主要介绍外泌体及其在糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)中的研究进展。

1 外泌体研究

1.1 外泌体的形成与特征 细胞会分泌各种类型的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，各种由细胞主动释放的纳米级膜囊泡被总称为EVs[4]。因为这些EVs的大小及分化机制不同，故将其分类为外泌体、凋亡小体及微泡。凋亡小体及微泡是由质膜直接出芽产生的，而外泌体的不同之处在于是早期核内体的限制膜向内出芽形成的。在这个过程中，成熟为多泡体(matrix vesiclesbodies，MVBs)[5]，MVBs再通过转运(endosomal sorting complex for transport, ESCRT)通路，使之与溶酶体融合而被降解亦或者与质膜融合，再由胞吐释放，即为外泌体[6]。

有研究表明，外泌体可以有效地将mRNA、miRNA甚至质粒DNA等载体运送到靶细胞[7]。在外泌体携带的诸多载体中，miRNAs可以通过转录后对具有识别位点的靶miRNA进行调控[8]，在发育、生理过程和疾病中发挥重要作用。miRNA是具有18～22个核苷酸的小型非编码RNA。它们参与了多种细胞过程，并可以在尿液等细胞外环境中被找到[9]。近年来，越来越多的研究指向了外泌体所携带的miRNAs，miRNAs可作为细胞间的内分泌或者旁分泌信号，调控细胞的表观遗传或介导细胞间的通信。故而外泌体miRNAs可以作为基础疾病的诊断标准以及参与疾病的治疗。外泌体因它的生理作用受到各个领域的广泛关注。

1.2 外泌体的分离与鉴定 外泌体密度和体积较小，且在粒径与组成方面存在异质性，这些因素都为外泌体的提取增加了难度。并且收集的样本可能还会存在大量高丰度杂质蛋白质，亦有许多与外泌体的生物物理学参数相似的细胞外囊泡，都会干扰外泌体的提取结果。所以，研究外泌体组成与功能的关键在于是否能够高效地提取出高纯度的外泌体。目前，有诸多提取外泌体的方法，包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、色谱法、免疫磁珠法等。每种技术都有其独特的优点和缺点。(1)超速离心法是目前应用最广泛、最可靠的离心方法[10]。它是根据不同密度和粒径的颗粒在离心力作用下的沉降速度不同，进而分离出外泌体。超速离心法分别在300、2000、10 000 g的离心作用下清除细胞、细胞碎片、细胞大囊泡。其优势在于方法成熟、成本低、适用于大体积样本。然而，该方法的缺点在于设备要求高、操作比较耗时，且易造成蛋白质聚集。(2)密度梯度离心法属于一种要求更高的超速离心法，它可以在超速离心法的一系列离心步骤后，采用蔗糖或碘沙醇作为介质进行超速离心。其原理为在离心力作用下，样品中的不同组分会沉降到等密度区，从而实现外泌体与样品中其他组分的分离。此方法效率高但也同样依赖昂贵的仪器[11]。(3)聚合物沉淀法通常使用将聚乙二醇作为介质，通过降低外泌体的溶解度，然后离心获得外泌体。聚合物沉淀法的优势在于操作简单、反应时间短，但该方法得到的外泌体纯度和回收率较低，并容易产生假阳性，可能会影响后续功能实验分析[12]。(4)色谱法则是依赖于色谱柱中分子的大小不同将外泌体提取出来，此方法得到的外泌体纯度较高，但获取量少且设备特殊。(5)免疫亲和捕获技术是根据标记物和抗体之间的特异性结合，从而由特定来源分离外泌体。其优点在于对样品的需求量较小，但储存条件较为苛刻、易产生干扰蛋白的缺点使此方法无法得到推广[13]。至于在研究人员提取外泌体的过程中采用何种技术，则取决于多种因素，包括起始基质(细胞培养基与生物液)、起始体积、下游分析和研究问题等。

此外，在外泌体分离后，需要进行外泌体的鉴定。外泌体的鉴定可以分为物理分析及化学分析，物理分析包括纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)、动态光散射(dynamic light scattering，DLS)、透射电镜(transmission electron microscope，TEM)和可调谐电阻脉冲传感(tunable resistive pulse sensing，TRPS)等，此类物理分析可以洞察颗粒的大小和浓度。化学分析通过染色、免疫印迹或蛋白质组学分析来完成，并且可以提供有关孤立的小泡含量的信息。

2 糖尿病肾病发病及治疗研究

2.1 外泌体参与DN的发病机制 DN的患病率随着糖尿病患者的增加也在不断上升，已发展成为危及人类健康的重要杀手。了解其发病机制对于DN的诊断和治疗至关重要，而目前DN的发病机制尚未明确，可能是多因素共同作用的结果。有研究表明，肾脏分泌的外泌体在高糖刺激下诱导的细胞-细胞间的相互交谈被认为在DN的发展和肾功能的下降中发挥着重要作用[14]。Wang等[15]研究发现，高糖诱导系膜细胞来源的外泌体通过增加TGF-β和TGF-β1/PI3K-Akt信号通路的分泌而诱导足细胞损伤，故含TGF-β1miRNA的外泌体可能是促进系膜扩张和肾纤维化的关键因子[16]。另外，来自高糖条件下的管状细胞源外泌体可能会调节成纤维细胞的增殖和激活，参与旁分泌信号机制，导致DN肾间质纤维化的发生[17]。其次，外泌体miRNA是DN进展中的关键调节因子，主要是在胰腺β细胞损伤和胰岛素抵抗方面[18]。另外，在高糖条件下，Caspase-11/4和GSDMS介导的凋亡被激活并参与足细胞丢失和DN的发展[19]。此外，在高糖处理后，小鼠巨噬细胞来源的EVs miR-21-5p可以通过靶向A20提高炎症小体NLRP3和IL-1β的水平，从而导致足细胞凋亡[20]。故外泌体及其miRNA可以通过介导多种病理因素来参与DN的发生和发展。

2.2 外泌体作为DN的诊断标志物 DN是糖尿病患者因肾脏结构和功能的改变而引起的严重并发症，若能在早期检测到DN的诊断性生物标志物，可及时使用药物减缓肾功能的丧失以及防止疾病进展。DN作为一种肾小球疾病，主要表现为K-W(Kimmelstiel-Wilson)病理性结节、肾小球系膜及基底膜增厚等。时至今日，DN传统诊断方法仍然是通过测量肾小球滤过率、肌酐清除率、血清肌酐和蛋白尿来间接监测肾功能，此类指标存在明显的滞后性及偏倚。肾脏病理穿刺发现典型的K-W结节仍然是诊断DN的“金标准”。但肾脏病理检查本身为一种有创性操作，存在禁忌证、并发症的风险，且该检查复检的可行性低，故寻求一种DN早期诊断的生物标志物至关重要。近年来，研究人员发现了外泌体作为生物学标记物，与DN密切相关，对预测疾病的发生及控制疾病的发展具有重要意义。

尿液作为发现肾脏疾病新生物标志物的理想生物样本，具有无创采集且方便简单的优势。Delic等[21]研究证明尿外泌体miRNA表达谱显示了Ⅱ型DN患者的差异miRNA特征，其中14种miRNA上调，2种miRNA下调，且下调至少2倍。另外，Khan等[22]研究证明，通过尿外泌体的蛋白质组学、尿可溶性蛋白的分析，可能有助于揭示DN进展中发生的病理生理改变。除了尿液来源外泌体，DN患者还有血清外泌体miRNA谱[23]。这些miRNAs均可能是诊断DN的候选标志物。

2.3 外泌体与DN的治疗 由于外泌体具有双层膜和纳米尺度大小的生物特性，外泌体可以保护“货物”不被补体固定或巨噬细胞清除，从而延长其循环半衰期，提高其生物活性。因此，外泌体可能被用作为治疗疾病的药物传递囊泡。Lee等[24]通过跟踪6例经活检证实的DN患者，在其活检时分离出尿外泌体，并通过二代测序分析包含的miRNA，最终找出了10个miRNA参与了已知的和新的DN发病机制信号通路。DN的进展和各通路密不可分，例如，在抑制足细胞Smad1/mTOR信号通路上，脂肪干细胞源外泌体(ADSCs derived exosomes，ADSCs-exo)通过增强miR-486的表达，可以明显缓解DN症状[25]。此后，该团队又发现ADSCs-Exo通过与ZEB2相关的机制对高糖诱发的足细胞上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程起到保护作用[26]。因此，ADSCs-Exo制剂可能是缓解足细胞功能障碍和DN临床症状的有效治疗策略。

此外，外泌体可以通过miR-4449调节促炎细胞因子的表达、ROS水平和细胞凋亡，遏制DN的病情进展[27]。Mao等[28]发现骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)衍生的外泌体miR-let-7a与USP22有靶向关系：miR-let-7a可通过升高或沉默USP22来降低血清肌酐、尿素氮等指标，抑制肾细胞凋亡和氧化应激，并抑制DN大鼠肾组织中N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达。人尿源干细胞(human urine derived stem cells, hUSC)外泌体中miR-16-5p过表达可保护高糖诱导的肾组织损伤，并促进血管内皮生长因子 A (vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)表达和足细胞调亡[29]。这些外泌体携带的miRNA参与了DN的发病机制，也为DN的治疗开拓了新空间。

除此之外，外泌体与巨噬细胞的交流在DN治疗中也有着举足轻重的地位，例如，外泌体miR-19b-3p介导了受损管状上皮细胞与巨噬细胞之间的沟通，使M1巨噬细胞被激活,故外泌体/miR19b-3p/SOCS1轴在肾小管间质炎症中发挥了重要的病理作用[30]，此轴也代表了肾脏疾病的一个新的治疗靶点。M2巨噬细胞亦可通过分泌外泌体miR-25-3p，抑制双特异性磷酸酶1的表达从而激活细胞自噬，达到缓解高糖诱导的足细胞损伤的目的[31]。

近年来，外泌体受到越来越广泛的关注，外泌体不仅可以维持机体的正常生命活动，而且参与调控了肿瘤、免疫、组织修复等领域。随着研究的深入，外泌体的提取愈发成熟，外泌体的更多功能被挖掘。但同样存在着一些问题与挑战：一是如何更快速、更高效、高纯度地提取外泌体，二是更多未知的外泌体及其miRNA怎样参与到DN的发病、诊断和治疗中，需要进一步研究探讨。