脑缺血再灌注损伤发病机制研究进展

王 璐, 张士滨, 华志鹏, 杨占君综述, 贾建新, 吴丽娥审校

缺血性卒中约占卒中总数的70%～80%[1],其以高发病率、高复发率和高致残率等特点成为威胁人类健康的主要疾病之一。当发生脑缺血后,首要的目标是改善缺血区域脑组织的血流供应,恢复正常的血流循环,目前临床主要的治疗方法是静脉溶栓、动脉取栓、改善侧支循环,绝大部分患者采取以上措施后临床症状得到改善,但仍有小部分患者出现临床症状加重的现象,此现象称为脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)。CIRI发生的具体机制目前尚未有确切的定论,有氧化应激损伤、炎症反应、自噬及兴奋性氨基酸的毒性作用等学说。本文根据对CIRI的机制研究进展进行综述,以期为临床改善CIRI带来的损害提供新的研究思路。

1 CIRI的发生机制

1.1 氧化应激(oxidative stress,OS) 氧化应激是体内细胞受外界影响,活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)过度激活与自由基异常增多,使氧化与抗氧化作用失衡,引发组织损伤的过程[2]。氧化应激在缺血性脑卒中具有重要作用。脑组织缺血以及缺血组织再灌注时,ROS大量产生,通过多种损伤机制破坏抗氧化系统,发生氧化应激损伤,导致细胞死亡。脑是高耗能器官,相对于其他器官和组织更加难以耐受缺血缺氧。脑组织缺血缺氧后,线粒体氧化呼吸链电子传递过程发生异常,超氧阴离子(O2-)产生增多,使歧化向H2O2转化,H2O2通过芬顿反应产生活性氧中最强的羟基[3]。羟基与DNA组分发生反应形成碱基修饰位点和无碱基位点,导致DNA损伤,通过启动下游DNA损伤位点进行识别,从而促使凋亡诱导因子核转位以及DNA修复酶降解,进而引起脑组织损伤[4]。

自由基是人体进行生命活动时产生的一种活性分子,具有调节细胞间信号转导与细胞生长以及抑制细菌和病毒的作用。生物体内有两大抗氧化应激防御系统,即酶性抗氧化系统和非酶性抗氧化系统。生理情况下,体内活性氧类等自由基水平与超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、泛素、血红素氧化酶、胆红素等自由基清除物质的水平处于动态平衡。组织缺血缺氧时,次黄嘌呤等物质大量堆积,当发生再灌注时,瞬间涌入大量的氧分子提供电子受体将次黄嘌呤经黄嘌呤氧化酶转化为尿酸,在这一过程中,超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等氧化应激产物大量产生,大量自由基堆积。自由基会破坏细胞膜的有效成分,使细胞骨架崩解,导致细胞死亡。同时,自由基会引发线粒体损伤,一方面导致能量衰竭,促使Ca2+内流,蛋白质水解,细胞膜及其骨架结构崩解破坏,细胞死亡;另一方面线粒体损伤可直接诱导细胞凋亡引起组织细胞坏死[5]。线粒体在细胞能量产生、钙稳态维持和ROS调节中起核心作用,线粒体功能障碍可加重氧化应激和细胞损伤。

核因子红细胞2-相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是一种具有神经保护作用的碱性亮氨酸拉链结构,可通过调控内源性氧化应激、抗炎等机制减轻CIRI。Shih等[6]研究发现CIRI模型大鼠敲除Nrf2基因后,脑梗死面积增大,抗氧化酶活性减低,神经功能缺损症状加重。Zhou等[7]研究表明,五味子甲素(Sch A)对CIRI有抗氧化、抗炎等作用,给予CIRI模型大鼠Sch A后SOD活性明显升高,MDA含量减少,而敲除Nrf2基因可抑制Sch A的神经保护作用,降低SOD活性,增加MDA含量,组织抗氧化能力减弱,表明Nrf2可通过抑制氧化应激减轻CIRI。

1.2 自噬(autophagy) 脑缺血后会出现中心缺血区和半暗带区,中心区神经细胞的死亡是细胞坏死,而半暗带区细胞的受损是细胞凋亡和自噬,故挽救缺血半暗带区域的脑细胞成为临床治疗缺血性疾病的关键方法。自噬是重要的物质分解代谢途径之一,指溶酶体吞噬、降解受损的细胞器以及错误折叠大分子蛋白的过程,从而维持机体内环境稳定状态[8]。自噬是一种高度保守的进化过程,通过溶酶体系统调节细胞器和蛋白质,进而维持细胞稳态。微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein llight chain 3,LC3)是与自噬相关的蛋白,LC3末端被Atg4酶裂解产生LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ与Atg3、Atg7以及磷脂酰乙醇胺(PE)相互结合生成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ存在于自噬体膜上,随着自噬体膜的形成而增加,其表达量可代表自噬水平[9]。p62是经典的自噬受体,是连接LC3蛋白和泛素化底物之间的桥梁。自噬体与溶酶体结合后p62可被降解,其表达水平与自噬呈负相关。Beclin-1是调控自噬上游的关键蛋白,在自噬过程中具有重要作用[10]。Nazarinia等[11]研究发现,大脑中动脉闭塞的大鼠脑组织中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达量明显增多。刘禹岐等[12]研究表明,CIRI模型大鼠神经功能评分、脑梗死体积以及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达量增加,p62表达量减少,给予淫羊藿次苷Ⅱ补充治疗后,神经功能评分、脑梗死体积、LC3-Ⅱ以及Beclin-1表达量下降,p62表达量增加,证明自噬参与CIRI过程。

1.3 凋亡 细胞凋亡是指为了维持内环境的稳定,由基因控制的细胞自主有序的死亡,是主动过程[13]。凋亡是多种基因控制的过程,涉及Bcl-2家族、caspase家族、细胞色素-C(cyt-c)、p53等。研究发现CIRI与凋亡有着密切的联系,但确切机制尚不完全明确。Caspase家族在细胞凋亡中起重要作用,它们均以酶原的形式存在,相关凋亡因素刺激后可活化并通过各种级联反应诱发凋亡。Caspase-3是凋亡的效应子,被上游启动子激活后作用于特异性底物使细胞发生改变,导致凋亡[14]。脑缺血时促凋亡蛋白Bax转移到线粒体外膜,增加线粒体外膜的通透性触发凋亡。cyt-c从线粒体释放到胞质中,从而激活caspase-3级联反应,导致DNA降解,最终导致脑损伤。与此同时,抗凋亡蛋白Bcl-2通过稳定线粒体膜电位和阻止cyt-c的释放来抑制细胞凋亡。王林等[15]研究发现,CIRI模型大鼠脑组织中caspase-3水平显著升高,使用丁苯酞后caspase-3水平明显下降,凋亡细胞数量减少,说明丁苯酞能够抑制CIRI引发的细胞凋亡,发挥神经保护作用。Bcl-2家族包括抑制凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1等)和促凋亡蛋白(Bax、Bad、Bak等),在细胞凋亡进程中发挥着重要的调节作用,当细胞处于缺血缺氧状态时,Bcl-2表达量降低,而Bax表达量增加[16]。

1.4 神经炎症 炎症反应是机体受损后局部或全身产生的一系列防御反应。相关文献报道[17],脑组织损伤后可见大量炎性因子浸润,这些炎性因子的过度表达会进一步继发神经细胞损害。炎性因子是促进梗死区域愈合以及瘢痕组织形成的重要因素,炎症反应在CIRI中发挥重要的作用,其具体机制目前仍未有确切的报道。白细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞是主要的效应细胞,通过释放大量炎性因子(IL-1、IL-6、IL8、TNF-α)产生炎症反应。白细胞主要由整合素、选择素、免疫球蛋白等介导炎症反应。急性脑缺血时,中性粒细胞与黏附分子结合后最早开始释放诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和基质金属蛋白酶(MMP)等炎症介质,加重脑组织缺血缺氧,使脑梗死面积扩大。小胶质细胞是神经系统中主要的巨噬细胞,也是固有免疫细胞。在中枢神经系统疾病中可检测到不同表型的小胶质细胞(M1型/M2型),分别发挥促炎和抗炎作用[18]。小胶质细胞被激活后可极化为M1型和M2型,M1型小胶质细胞可分泌大量活性氧类、细胞因子和蛋白水解酶促进炎症反应的发生加剧神经细胞的损伤,而M2型小胶质细胞分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子促进炎症的消退以及脑损伤的恢复[19～22]。组织缺血缺氧后,静息状态的小胶质细胞形态和功能发生变化,激活为M1型(促炎型),分泌促炎因子发生炎症反应。随着M1型活化的后期M2型(抗炎型)小胶质细胞激活,M2型可以吞噬坏死的细胞碎片,抑制炎症反应的进展,促进神经元再生,发挥神经保护作用[18]。相关研究表明[23],牡荆素可以抑制CIRI模型大鼠缺血区域CD16/32(M1型标志物)的表达,增加CD206(M2型标志物)的表达,可能是通过促进小胶质细胞M2型的极化来发挥保护作用的。

1.5 钙超载 生理情况下,细胞内Ca2+主要位于线粒体和肌浆网中,细胞外Ca2+是细胞内Ca2+浓度的10000倍左右。当发生缺血性脑卒中时,脑细胞血流中断,氧气和ATP供应不足,线粒体功能障碍,Na+-K+-ATP酶等离子通道不能维持正常的电化学梯度,使电压门控通道持续开放,大量Ca2+内流[24]。Ca2+蓄积促使兴奋性氨基酸(如谷氨酸等)大量产生,谷氨酸与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体结合,也可引发大量Ca2+内流,形成钙超载,从而进入一系列的恶性循环。细胞内Ca2+增多,与钙调蛋白(CaM)结合产生大量CaM-Ca2+复合物促使5-羟色胺、肾上腺素等缩血管因子释放,导致血管痉挛,加重脑组织缺血缺氧。由于钙超载和氧化应激通过各种反应使线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放,大量ROS进入细胞内导致线粒体损伤,同时细胞色素C被释放到胞浆中与促凋亡因子结合,触发凋亡级联反应,激活促凋亡蛋白caspase-3导致神经细胞死亡[25]。

1.6 兴奋性氨基酸 兴奋性氨基酸主要包括谷氨酸和天冬氨酸,是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质,大多数存在于突触末梢,在神经元与神经元之间的信息传递中发挥重要作用。谷氨酸主要存在于神经细胞中,N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)可与其结合发挥兴奋神经细胞的作用。生理情况下,兴奋性氨基酸可参与突触的兴奋传递,有助于学习记忆。但在病理情况下,大量谷氨酸聚积,可引发神经系统过度兴奋,导致神经系统能量代谢失衡,产生神经毒性作用[26]。NMDA受体是离子型门控通道,对Ca2+具有通透性,大量谷氨酸与NMDA受体结合使Ca2+持续内流导致Ca2+超载,并且可以通过一系列反应使ROS增多,引发神经细胞死亡。

2 CIRI的治疗

近年来,对于CIRI的治疗也引起了人们的广泛关注。脑缺血再灌注过程会产生大量的氧自由基和脂质过氧化物,导致氧化和抗氧化系统失衡,加重神经细胞损伤。依达拉奉是临床广泛使用的脑保护剂,可清除体内过多的氧自由基,抑制脂质过氧化物沉积,减轻血管内皮损伤,抑制神经细胞氧化应激损伤,防止脑梗死和脑水肿的进展,延缓神经细胞死亡,减轻脑损伤[27]。褪黑素是由松果体分泌的神经内分泌激素,是强大的内源性自由基清除剂,通过激活抗氧化酶和清除过量自由基参与抗氧化过程,在脑卒中和心肌梗死等疾病中发挥保护作用[28]。脑缺血后炎症因子局部浸润,会加重脑组织损害,大量炎症因子的释放会导致血管内皮受损,放大炎症反应甚至诱发神经细胞凋亡。他汀类药物是HMG-CoA还原酶抑制剂,具有降低胆固醇、低密度脂蛋白的作用,临床用于治疗动脉粥样硬化。近来研究发现,他汀类药物还具有改善血管内皮功能、减少炎症因子的聚集以及防止血栓形成等作用[29],亦广泛运用于CIRI。丁苯酞是一种人工合成的消旋体,具有保护线粒体功能、改善微循环和缺血区域脑组织的血流量、减轻脑水肿、促进能量代谢等作用[30],丁苯酞能够通过保护线粒体功能促进能量代谢来发挥神经保护作用。在临床中广泛应用于神经系统疾病。近年来,对天然药物的研究越来越受到人们的关注,肉苁蓉总苷、银杏叶、黄芪、姜黄素、葛根素、人参、多糖类等被证实对CIRI有较好的疗效[31]。除了药物治疗外,针刺也应用于CIRI的治疗中,其作用机制可能与减轻氧化应激损伤、抑制炎症反应和凋亡、促进血管内皮增生以及拮抗兴奋性氨基酸毒性等[32]有关。

3 展 望

综上所述,脑缺血再灌注损伤是多种病理生理机制参与的复杂反应,主要涉及氧化应激、炎症反应、自噬、凋亡以及兴奋性氨基酸的毒性作用等。减少脑梗死的体积、减轻神经功能缺损症状、抗氧化应激损伤和炎症反应、改善患者的生存质量等是临床研究CIRI亟需解决的难题。虽然近年来一些药物可以改善CIRI,但具体作用机制尚未明确,仍需我们进一步研究。希望日后能对CIRI机制中涉及的相关信号通路展开更深入的研究,以期为临床治疗CIRI提供新的思路和靶点。