二代测序技术在胸腔积液病因诊断中的应用进展

滕佳凝 魏 丽

山东第一医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，山东 泰安 271000

胸腔积液是多种疾病都可能引起的临床表现，经过胸部影像学检查能明确其诊断，但其病因复杂。通过分析积液的性质，临床将其分为漏出性胸腔积液和渗出性胸腔积液。漏出性胸腔积液的最常见病因为充血性心力衰竭，在急性肾小球肾炎、肝硬化等疾病中也可见到。而渗出性胸腔积液，常见有结核性胸腔积液、类肺炎性胸腔积液、恶性胸腔积液，其中结核性胸腔积液在临床渗出性胸腔积液中最为常见［1-2］。通常情况下，对患者采取胸腔穿刺或闭式引流，在治疗的基础上同时获取用于分析的胸腔积液，并对其进行检验，以明确胸腔积液的性质。相关研究显示，不明原因的胸腔积液在临床病例中所占比例可达20%左右［3］。若要对胸腔积液进行根本性的治疗，需要进一步明确其产生的病因。

二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术是一项正在飞速发展的新兴技术，拥有着诸多优点，有望成为主流的检测方式之一。本文将主要对目前临床上胸腔积液的传统检验及检测、NGS对诊断胸腔积液病因的价值以及选取胸腔积液作为样本进行NGS检测的可行性作一综述。

1 胸腔积液的传统检测项目及其局限性

临床上，想要明确胸腔积液的病因首先要区分其性质，常用区分其性质的检查包括胸水常规、生化检查、微生物学检验、免疫学检验及细胞学检查等。其中，在良恶性胸腔积液鉴别方面，酶学检测中乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）以及腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）的检测被认为有较大诊断价值。研究表明，结核性胸腔积液中ADA的水平升高，脓性及肿瘤性胸腔积液中LDH显著升高［4］。此外，免疫学检测中肿瘤标志物、肿瘤坏死因子、白细胞介素、类风湿因子、C-反应蛋白等指标也具有较高价值。肿瘤标志物包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、鳞状细胞癌相关抗原（squamous cell carcinoma associated antigen，SCCA）、神经元特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）、细胞角蛋白19的可溶性片段（Cyfra21-1）等［5］，在鉴别良恶性胸腔积液中发挥重要的作用。佟威威等［6］研究表明，Cyfra21-1 及NSE等肿瘤标志物在恶性胸腔积液中的水平明显升高，且其水平与疾病的严重程度呈正相关。以上指标在诊断中仅起到一定辅助作用，恶性胸腔积液鉴别诊断的“金标准”仍是通过细胞学检查寻找肿瘤细胞［7］，如发现肿瘤细胞即可诊断恶性胸腔积液。对于疑似感染引起的胸腔积液，有细菌涂片、培养，真菌涂片、抗酸染色等微生物检查来进一步寻找其病因。

临床常见的检测项目有一定的局限性：微生物培养需要至少3 ～ 7天，结核分枝杆菌的培养时间则更长，易延误治疗，而且其总体阳性率较低。有研究表明，仅有56%的病例中获得阳性培养物［8］。另外，一些特殊病原体很难通过培养获得，如军团菌、支原体、衣原体等；胸水脱落细胞学的总阳性率约在40% ～ 87%之间［9］，且其受外来因素影响较大。这使一些胸腔积液经过常规检查后仍不能明确诊断。临床上对这种患者更多采用胸膜活检，取材后再通过组织学、细胞学与病原学检查明确诊断。经皮穿刺胸膜活检创伤小，更易为患者所接受，但取材阳性率相比胸腔镜低［10］。近年来，胸腔镜作为安全、有效、易操作的微创检查技术，在诊断胸腔积液病因中的应用越来越广泛，与常规检查相比，其更能增加胸腔积液病因的检出率［11-13］，但在胸膜腔严重粘连，不能建成良好的人工气胸带，术前反复行胸腔穿刺，氧饱和度在吸氧后仍低，不能耐受低氧以及病程长、年纪大的患者中仍受一定的限制［14］；且胸膜活检为有创检查，并非每一位患者都能接受，在临床上很难大范围开展。选用胸腔积液，有采集方便、创伤小等优点。因此，选用胸腔积液作为样本，选取更准确的检测方法对临床诊断及治疗有极大的价值。探究更准确、快捷的检测新方法，来满足临床诊断的需要，是目前需要关注的重点。

2 NGS的优势及不足

NGS 也被称为高通量测序，是一种高通量、检测时间短、准确度高、信息量大的新一代检测方法。它可以同时对数千至数亿个DNA 片段进行独立的测序。在微生物检测、肿瘤诊断及其靶向药物治疗指导等方面有较大的临床价值［15］，受抗生素、厌氧环境的限制也较小［16-17］。在癌症研究方面，NGS 通过设定可以关注多个靶向区域，其中包括已知的驱动基因，且可以识别序列变异，其结果具有较高的可信度和准确性［18-19］。研究表明，NGS 更易检测基因突变，包括罕见基因，进而指导靶向药物治疗［20］。

在病原微生物检测方面，可分为靶向基因检测（target next-generation sequencing，tNGS）和宏基因检 测（macro next-generation sequencing，mNGS）。tNGS 对从样本中提取的DNA 使用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)引物组进行扩增，并对得到的扩增子进行测序，对比数据库以确定样品中存在的微生物及其相对丰度。检测目标仅涵盖预定好的病原体，不会受到背景菌及人源核酸的影响，且其操作简便、成本较低，更适合用于临床常规病原学检测。tNGS 对于耐药基因及突变检测有较高的敏感性，在某些遗传性疾病的诊断及研究中也发挥着重要作用［21］。mNGS 不依赖PCR，直接对样本中的总核酸进行高通量测序，并为检测到的所有基因产生相对丰度信息。其优点包括： 检测范围广、种类多，无需培养，可检测出多重感染以及灵敏度高等［22-25］。mNGS 可以更全面地识别混合肺部感染的病原体。几乎所有病原体，如病毒、细菌、真菌、寄生虫等，都可在一个单一样本中检测识别出来［26-27］，能有效提高诊断效率。有研究显示，mNGS对肺部感染病原体的总体阳性率为82.14%，明显高于常规检测的35.71%［28］。Wang 等［29］研究显示，mNGS诊断混合肺部感染的灵敏度和特异度分别为97.2%和63.2%，而选用传统的检验，其灵敏度和特异度分别为13.9%和94.7%。由此可见mNGS在灵敏度方面有显著的优势。

无论是mNGS还是tNGS，都具有灵敏度高及速度快等优势，最快在24 h 内可以出结果［16］，在临床相关疾病诊断和治疗方面具有很大的指导价值。Xu等［30］提供的1项临床案例显示，通过NGS在送检样本鉴定出大量鲍曼不动杆菌，实现了重症肺炎的快速诊断，为制定抗生素治疗方案提供了及时且有效的信息。在诊断疑难杂症方面，Wu等［31］报道了1例运用NGS 技术成功检测不明原因胸腔积液的病例，患者住院期间胸水、痰、血培养均为阴性，NGS结果显示肺泡灌洗液中存在阴道加德纳菌。此外，也有1 例不明原因胸腔积液的患者，在常规病原学检查得到阴性结果后，送检NGS，最终检测出星座链球菌［32］。这些案例可以证实NGS 可以有效诊断传统培养显示阴性结果的疑难病例。

虽然NGS 具有的种种优点被认为有可能取代传统病原学检测方法，但其依旧存在一些局限性：mNGS 在区分定植菌、背景菌与感染及外来污染的能力较差。目前尚无权威的指南来解读mNGS的报告，这对临床医生仍是个巨大的挑战［33-34］；另外，其成本较常规检测高，很难在临床上大规模开展；tNGS虽然成本较低，但只针对设定好的病原体进行检测，其结果阴性率较高。这些缺点仍需要进一步的研究及技术克服。

3 胸腔积液检测中NGS的应用

虽然NGS 诊断疾病的相关研究为目前国内外学者关注的重点，但利用胸腔积液来进行NGS检测的相关文献依旧很少，大部分研究选取肺泡灌洗液作为样本进行检测。这与肺泡灌洗液的检测可靠性相对更高有关［35］，但这并不能否定胸腔积液在NGS检测方面的临床价值。由于上呼吸道与外界相通，有很多外来微生物，口咽处也有很多正常定植细菌及共生生物，自然咳出的痰易受其污染。因此留取标本的质量不能保证，应用NGS检测痰液可能具有一定的局限性［36-37］。而支气管镜肺泡灌洗液直接取于病变的部位，受口咽部定植菌污染小，病原学检测准确率较高［38］。但其为侵入性检查，仍存在一些相关并发症（如气道痉挛等）［39］，并非所有患者都能接受此检查。胸腔积液作为样本进行NGS 的可行性也通过一些研究得以证明，Yi等［40］对某血液及痰液培养均为阴性的患者胸腔积液行NGS，成功检测出嗜肺军团菌，其原始读数为2 867个。给予莫西沙星治疗后，患者症状在1 周内消失，再行NGS，未测出嗜肺军团菌。Guo等［41］在探讨mNGS对儿童侵袭性肺炎球菌病的诊断价值的研究中发现，选用胸腔积液的试验组灵敏度（90.9%）远大于实验室培养的灵敏度（36.3%）。此外，Kanellakis等［42］对成人胸膜感染病原体的研究也证实了选取胸腔积液进行NGS从而明确诊断的可行性。胸膜腔具有无菌的特性，这使得其涂片或者培养的阳性率较低［43］。但从另一方面来说，当患者出现胸腔积液的临床表现时，若其是病原体感染引起，以胸腔积液作为标本得到的结果或许更有利于临床医生诊断病因；且胸腔积液的获取更为方便，更易为患者所接受。因此在临床上大规模开展的可能性更高。

对于患有肺部恶性肿瘤，尤其是非小细胞肺癌患者，晚期常伴有恶性胸腔积液，此时大多数患者已不耐受手术，难以获取肿瘤组织标本。因此，可考虑选择胸腔积液行NGS检测特定基因突变，从而对患者制定个体化的靶向治疗。另一方面，肺癌患者的免疫功能较差，在治疗期间容易发生致病菌感染等情况。感染的部位多为肺部［44］，也可累及胸膜。当患者出现感染时，往往会导致病情加速恶化，对后期的治疗产生不利影响，需要尽早进行干预［44-45］。当患者出现胸腔积液时，选用NGS 可鉴别是恶性胸腔积液还是感染引起的胸腔积液，从而进一步选择合适的治疗方案，这对肺癌患者的临床治疗及预后有着重要的意义。

4 总结与展望

NGS 作为一种新兴技术手段，冲破了传统检验的局限，为快速、准确的诊断患者病因提供了一种新的可能。在检测罕见病原体、混合病原体及重症感染方面显示出明显的优势，在肺恶性肿瘤晚期患者行特定基因突变检测方面也有着重要意义。虽然目前无法替代传统方法成为临床疾病诊断的“金标准”，但可作为一种有效的补充方法。而对于一些新发、疑难感染性疾病及免疫缺陷的患者，则可作为一线的检测方法。在NGS的样本选取上，胸腔积液拥有诸多优势。临床上患者对胸腔穿刺引流的接受度也较高，对于癌症晚期患者，选取胸腔积液也是相对简便可行的办法。综上所述，对不明原因的胸腔积液患者，抽取其胸腔积液行NGS 检测，对临床疾病明确诊断和早期干预有着重要的意义。

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