β-葡聚糖对大鼠毛囊的影响

李丹 吴伟东 王瑛 古佳升 桃卓嫣 方明星 费松

【摘 要】目的 探討不同浓度β-葡聚糖对大鼠皮肤组织毛囊生长及VEGF表达的影响。方法 选取SPF级Wistar大鼠18只随机分为3期实验，各6只，于背部划分4个部位，根据注射不同浓度的试剂分为4组，对照组注射1.00 ml，实验组A注射0.75 ml生理盐水+0.25 mlβ-葡聚糖，实验组B注射0.50 ml生理盐水+0.50 mlβ-葡聚糖，实验组C注射1.00 mlβ-葡聚糖，分别于注射7、14、28 d后处死大鼠，取其注射部位组织制成切片，经HE染色后观察毛囊生长状况，qRT-PCR法检测组织VEGF表达水平。结果 第7、14和28天大鼠皮肤均未见明显肿块、炎症和坏死等不良反应，经解剖后未见大鼠皮下出现组织坏死、炎症反应和血管栓塞等不良反应；第7天各实验组HE染色切片结果较对照组均未见明显变化；第14、28天各实验组毛囊生长活跃，毛囊内的毛乳头细胞增大，巨噬细胞浸润、胶原纤维增生和新生血管形成；各实验组7 d后毛囊生长情况和VEGF表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；14、28 d后各实验组毛囊生长较对照组活跃，且VEGF表达水平升高（P<0.05）；且随着β-葡聚糖浓度升高效果越确切。结论 β-葡聚糖可提高大鼠皮肤组织的VEGF表达水平，促进大鼠毛囊生长，且高浓度β-葡聚糖效果更佳。

【关键词】β-葡聚糖；毛乳头细胞；毛囊

中图分类号：TQ658.5 文献标识码：A 文章编号：1004-4949（2023）02-0006-05

Effects of β-glucan on Rat Hair Follicles

LI Dan1， WU Wei-dong1， WANG Ying2， GU Jia-sheng1， TAO Zhuo-yan1， FANG Ming-xing1， FEI Song1

（1.Department of Cardiothoracic Surgery， Guangzhou Red Cross Hospital of Jinan University， Guangzhou 510000， Guangdong， China； 2.Guangzhou Xiaomanyao Medical Equipment Co.， Ltd.， Guangzhou 510000， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To investigate the effects of different concentrations of β-glucan on hair follicle growth and VEGF expression in rat skin tissue. Methods Eighteen SPF Wistar rats were selected and randomly divided into three phases， with 6 rats in each group. Four parts were divided on the back. According to the injection of different concentrations of reagents， the rats were divided into four groups. The control group was injected with 1.00 ml of normal saline， the experimental group A was injected with 0.75 ml of normal saline+0.25 ml of β-glucan， the experimental group B was injected with 0.50 ml of normal saline+0.50 ml of β-glucan， and the experimental group C was injected with 1.00 ml of normal saline β-glucan. The rats were sacrificed at 7， 14 and 28 days after injection， and the tissues at the injection site were taken and made into slices. The growth of hair follicles was observed after HE staining， and the expression level of VEGF in tissues was detected by qRT-PCR. Results On the 7th， 14th and 28th day， no obvious mass， inflammation， necrosis and other adverse reactions were found in the skin of rats. After dissection， no adverse reactions such as tissue necrosis， inflammatory reaction and vascular embolism were found in the subcutaneous tissue of rats. On the 7th day， there was no significant change in the results of HE staining in each experimental group compared with the control group. On the 14th and 28th day， the hair follicles of each experimental group grew actively， the dermal papilla cells in the hair follicles increased， macrophage infiltration， collagen fiber hyperplasia and neovascularization formed； there was no significant difference in hair follicle growth and VEGF expression between the experimental groups and the control group on the 7th day （P>0.05）. On the 14th and 28th day， the growth of hair follicles in each experimental group was more active than that in the control group， and the expression level of VEGF was increased （P<0.05）. And with the increase of β-glucan concentration， the effect is more accurate. Conclusion β-glucan can increase the expression level of VEGF in rat skin tissue and promote the growth of rat hair follicles， and the effect of high concentration β-glucan is better.

【Key words】β-glucan； Dermal papilla cells； Hair follicles

目前脱发的治疗方式有外用米诺地尔等药物、植发和富血小板血浆局部注射等方式[1]。但现有治疗方法的疗效差异较大，无法满足患者的治疗期望，存在一定的局限性。因此需要开发效果更好的治疗方法和药物。β-葡聚糖是以葡萄糖为单糖组成的同型多糖，能激活免疫系统、活化巨噬细胞[2，3]，诱导巨噬细胞分泌VEGF等生长因子[4，5]，促进胶原纤维和血管生成。毛发起源于毛囊，临床认为[6]，保护毛囊免受活性氧损伤和促进血管生成是维持毛囊生长的两种基本机制；且高糖环境有利于毛发生长相关基因的表达和毛发生长[7]。由于β-葡聚糖能通过激活巨噬细胞诱导巨噬细胞分泌VEGF，也能通过组蛋白去乙酰化酶5诱导血管生成[8]，其分解中间产物葡萄糖能为毛乳头细胞提供高糖环境，上述机制均与调控毛囊生长相关。基于此，本研究通过对比不同浓度β-葡聚糖对大鼠毛囊生长状态和组织VEGF表达水平，探讨β-葡聚糖对大鼠毛囊生长的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级Wistar大鼠18只，周龄6周，体重（200±20）g（均购自南方医科大学实验动物管理中心）。动物实验符合动物伦理，伦理号（穗红医院轮审2022-011-01），本實验按照《国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》进行。大鼠在室温（25±2）℃，相对湿度（50±5）%，12 h明暗交替的环境下分笼饲养，自由摄食饮水，饲养7 d。

1.2 试剂与仪器 β-葡聚糖（广州硕谱生物科技有限公司）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；二甲苯（天津市富宇精细化工有限公司）；伊红染液、苏木素染液；中性树胶（谷歌生物科技有限公司）；显微镜（上海通灏光电科技有限公司）；摊烤片机（湖北安立信医疗实业有限公司）；脱水机（武汉俊杰电子有限公司）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；实时荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）；VEGF和GADPH引物（广州伯信生物科技有限公司）。

1.3 实验分组 18只大鼠按编号后采用完全随机抽样法分为3期实验，各6只，分别为7 d 1期实验、14 d 2期实验和28 d 3期实验，大鼠背部各选取4个注射点，注射间隔1 cm以上，各点注射剂量均为1 ml，注射试剂分组与细胞分组相同，见表1。

1.4 方法

1.4.1试剂注射 18只大鼠禁食12 h、禁水4 h后，称重，采用7%水合氯醛（0.03 ml/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后对大鼠背部皮肤进行备皮，选取脊柱旁两侧约2 cm皮下组织为注射中心点，以注射点中心划分1.5 cm宽度的正方形区域使用记号笔标注，1只大鼠背部脊柱两侧分别标注4个区域。消毒后各部位注射1 ml材料，注射后予以轻度按摩使材料分布更均匀。注射完成后常规饲养，于7、14、28 d后分别采用脊髓脱臼法处死对应实验期组大鼠，去除大鼠背部毛发后拍照记录，对标记笔标注的注射区域用手术刀切开皮肤全层并拍照记录，使用蚊式钳钝性分离剩余的注射材料及周围组织，保持包膜完整。

1.4.2苏木精-伊红染色法 剪取皮肤组织，10%甲醛溶液中固定48 h。流水洗去甲醛后将包埋块置于网兜中，放入70%乙醇过夜。第2天依次放入80%、90%、100%A、100%B乙醇浸泡各1 h，二甲苯A、二甲苯B各浸泡30 min，至组织块呈现棕黄色或暗红色透明状，放入水浴机石蜡缸A、B、C各1.5 h（60 ℃），包埋块和包埋模具放入包埋仪b中至少30 min，包埋后关闭水浴箱，使用莱卡切片机切片，厚度为4 μm，45 ℃摊片，烤片机75 ℃烤片60 min。将石蜡切片放入染色盒，用二甲苯A、B、C各脱蜡5 min。依次置于100%、95%、80%、70%酒精中，5 min/次，入蒸馏水2次，5 min/次。苏木素染核1 min，流水冲洗干净，0.1%盐酸酒精分化10 s，入蒸馏水放置10 min。0.5%伊红染色1 min，流水冲洗干净，入蒸馏水3 min，取出玻片放在通风橱里晾干。用中性树胶对晾干的组织切片进行封片。在光学显微镜下找到目标部位，拍照。

1.4.3毛囊状态评价 选取切片组织毛囊所处部位的3个视野拍照并记录。若选取视野下可见总毛囊数量低于10个，则舍弃该视野，选取另一个视野，计算处于生长期的毛囊占总毛囊的比例，结果取平均值。

1.4.4 qRT-PCR法检测VEGF的表达 利用Trizol试剂从组织中提取总RNA，NanoDrop检测RNA浓度及纯度，使用qRT-PCR检测VEGF水平。反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。VEGF相对表达量以GADPH为内参照，前引物GTTCGAGGAAAGGGAAAGGGTC，后引物GCGAGTCTGTGTTTTTGCAGGA，GADPH前引物GGCATCCTGACCCTGAAGTA，后引物GGGGTGTTGAAGGTCTAAA，采用2-ΔΔCt法对细胞中VEGF的表达水平进行相对定量分析。实验重复3次。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件处理本研究数据，计量资料以（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠皮肤和皮下大体观 第7、14和28天大鼠皮肤均未见明显肿块、炎症和坏死等不良反应，经解剖后未见大鼠皮下出现组织坏死、炎症反应和血管栓塞等不良反应，见图1。

2.2 大鼠皮肤HE染色切片结果 第7天各实验组较对照组均未见明显变化；第14、28天各实验组毛囊生长活跃，毛囊内的毛乳头细胞增大，巨噬细胞浸润、胶原纤维增生和新生血管形成，见图2。

2.3 各组大鼠毛囊生长状态评价 第7天各实验组毛囊生长情况与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；第14、28天各实验组生长期毛囊比例高于对照组，C组比例最高，差异有统计学意义（P<0.05）；各实验组生长期毛囊比例均呈上升趋势，见表2。

2.4 各组大鼠组织VEGF水平比较 为了避免切片镜下选取引起的误差，本研究检测了大鼠真皮组织中的VEGF的表达水平。除对照组外，各实验组VEGF表达水平均呈上升趋势，第7天表达水平组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）；第14、28天各实验组VEGF表达水平均高于对照组，且实验组C的表达水平最高，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。

3 讨论

毛囊是一个结构复杂且非常活跃的器官。毛囊的生长受到胰岛素样生长因子-1、肿瘤生长因子-β和VEFG等的调控[6]。毛囊基底部的毛乳头细胞和角质形成细胞是毛囊周期調节的关键参与者[7-9]，其中毛乳头细胞是一种特殊的毛发间充质成分，内含有毛细血管。毛乳头细胞分泌的各种生长因子能够调控毛囊生长，在毛发的形态发生和再生生长中起着非常重要的作用[10]。毛囊周期分为生长期、休止期和为脱落期，约90%的毛发处于生长期，其余10%处于休止期和脱落期。调节毛乳头细胞的活跃状态、可促进毛囊从休止期进入生长期，调控毛囊生长。

葡聚糖根据糖苷键连接的类型不同分为α-葡聚糖和β-葡聚糖。α-葡聚糖中包括具有代表性的血浆替代品右旋糖酐[11]。β-葡聚糖的活性较α-葡聚糖更活跃，β-葡聚糖具有调节血脂和血糖、降低胆固醇、抗肿瘤、调节免疫功能、调节肠道菌群等活性，能减少伤口炎症并促进伤口愈合[12]，或作为药物载体传输特定药物靶向治疗疾病[13]，在治疗银屑病上也有较大的潜力[14]。此外，β-葡聚糖还能促进毛囊生长[15]。β-葡聚糖可被免疫活性细胞膜上的受体识别，激活包括巨噬细胞在内的免疫细胞，诱导巨噬细胞分泌VEGF。高糖环境使糖酵解介导的组蛋白乙酰化增加，引起增加毛发诱导基因的表达和毛干的延长。考虑到VEGF在毛发生长周期中介导血管生成中起着重要作用，以及视野选取可能引起的一定误差，因此本研究检测了组织的VEGF表达水平。本实验结果显示，各实验组第7天毛囊生长情况和VEGF表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；第14、28天各实验组毛囊生长较对照组活跃，且VEGF表达水平升高（P<0.05）；且随着β-葡聚糖浓度升高效果越确切，说明β-葡聚糖激活巨噬细胞分泌VEGF，引起VEGF水平升高，VEGF进一步作用于毛囊，诱导毛囊进入生长期或维持和促进毛囊生长，同时β-葡聚糖代谢产生的葡萄糖为毛乳头细胞提供了有利的高糖环境，毛乳头细胞代谢活跃分泌包括VEGF在内的各种生长因子营养毛囊细胞，并促进毛发诱导基因的表达和毛干的延长。大鼠毛囊生长周期较短，约为28 d[16]，因此在第14、28天已经可见差异，注射β-葡聚糖后可见毛囊和血管生长。本实验不足之处在于仅验证了不同浓度的β-葡聚糖对大鼠毛囊的生长和皮肤组织的VEGF表达产生的影响，没有检测其他可能参与调控毛乳头细胞或毛囊的生长因子，β-葡聚糖与毛乳头细胞和毛囊的关系仍需进一步研究。

综上所述，β-葡聚糖可提高大鼠真皮层的VEGF表达水平，并提供高糖环境，促进毛囊毛发生长，且全浓度的β-葡聚糖效果更佳。

参考文献

[1] 毕雪婵，吴艳.真皮注射交联透明质酸的抗衰老机制[J].临床皮肤科杂志，2022，51（8）：498-500.

[2] 林泽森，刘东敏，刘亚雄，等.含有1，3-β葡聚糖和植物提取复配物的保湿研究[J].广州化工，2022，50（2）：53-55.

[3] 张译心，罗倩，梁瀚文，等.注射用聚左旋乳酸微球体内可促胶原再生[J].中国组织工程研究，2022，26（34）：5448- 5453.

[4] Stothers CL，Burelbach KR，Owen AM，et al.β-Glucan Induces Distinct and Protective Innate Immune Memory in Differentiated Macrophages[J].J Immunol，2021，207（11）：2785-2798.

[5] 王梓权，樊平，周杰，等.巨噬细胞在血管生成中的作用[J].中国免疫学杂志，2021，37（22）：2710-2714.

[6] Zerbinati N，Sommatis S，Maccario C，et al.In Vitro Hair Growth Promoting Effect of a Noncrosslinked Hyaluronic Acid in Human Dermal Papilla Cells[J].Biomed Res Int，2021，2021：5598110.

[7] Choi M，Choi YM，Choi SY，et al.Glucose metabolism regulates expression of hair-inductive genes of dermal papilla spheres via histone acetylation[J].Sci Rep，2020，10（1）：4887.

[8] Choi M，Lee SM，Lee JW，et al.Yeast beta-glucan mediates histone deacetylase 5-induced angiogenesis in vascular endothelial cells[J].Int J Biol Macromol，2022，211：556-567.

[9] Ryu YC，Lee DH，Shim J，et al.KY19382，a novel activator of Wnt/β-catenin signalling，promotes hair regrowth and hair follicle neogenesis[J].Br J Pharmac ol，2021，178（12）：2533-2546.

[10] 劉芳，苗勇，胡志奇.毛乳头细胞生物学特性的研究进展[J].中华整形外科杂志，2021，37（5）：567-570.

[11] Gupta K， Amboiram P，Balakrishnan U，et al.Dextrose Gel for Neonates at Risk With Asymptomatic Hypoglycemia：A Randomized Clinical Trial[J].Pediatrics，2022，149（6）：e2021050733.

[12] Abedini F，Mohammadi SR，Dahmardehei M，et al.Enhancing of Wound Healing in Burn Patients through Candida albicansβ-Glucan[J].J Fungi（Basel），2022，8（3）：263.

[13] Valachová K，？oltés L.Hyaluronan as a Prominent Biomolecule with Numerous Applications in Medicine[J]. Int J Mol Sci，2021，22（13）：7077.

[14] Lan J，Li Y，Wen J，et al.Acitretin-Conjugated Dextran Nanoparticles Ameliorate Psoriasis-like Skin Disease at Low Dosages[J].Front Bioeng Biotechnol，2022，9：816757.

[15] Kang X，Lei J，Yang C，et al.A hybrid hydrogel composed of chitin and β-glucan for the effective management of wound healing and scarring[J].Biomater Sci，2022，10（20）：6024-6036.

[16] 范阔海，张敏爱，胡燕姣，等.NFATc1在小鼠毛囊生长周期中的定位和表达[J].山西农业大学学报（自然科学版），2022，42（4）：113-118.

编辑 刘雯