鸢乌贼胴体肌肉除酸工艺的响应面优化

李翰卿,马俪珍,陈胜军,王悦齐,黄卉,胡晓,4,潘创

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部水产品加工重点实验室/国家水产品加工技术研发中心,广东 广州 510300;2.三亚热带水产研究院,海南省深远海渔业资源高效利用与加工重点实验室,海南 三亚 572018;3.天津农学院食品科学与生物工程学院,天津 300384;4.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心,大连工业大学,辽宁 大连 116034)

鸢乌贼(Sthenoteuthisoualaniensis)属柔鱼科(Ommastrephidae)、鸢乌贼属(Sthenoteuthis),是温带海洋性大洋鱼种,大量生长、繁殖于中国南海中部及南部地区,易于捕捞。可食部位占总体积的81.10%,体内含有多种丰富的人体必需氨基酸,其蛋白质含量高、脂肪含量低,是优质的海产品原料[1]。调查评估显示,中国鸢乌贼总资源量远高于现捕捞量[2],商业开发鸢乌贼仍处于空白状态,有极大的商业开发潜力[3]。肌肉的酸涩味阻碍鸢乌贼商业开发,奥品(Opine)类物质是鸢乌贼肌肉发酸的主要原因[4]。在中国南海,鸢乌贼是国内捕捞渔船的大宗捕获渔获物,《2022年中国渔业统计年鉴》显示,2021年全国鱿鱼(Squid)捕获量比2020年上升了4.33%,章鱼(Octopus)增加了1.36%,而乌贼(Sepiidae)捕捞量提升了5.99%。通过中国水产科学研究院南海水产研究所渔业调查评估显示,南海鸢乌贼总资源量为204.94万t,个体质量0.30 kg,可捕量为99.40万t,而中国每年捕捞量仅有8.00万t,鸢乌贼明显处于待开发状态,有极大的商业开发价值[1]。脱除酸味是鸢乌贼加工需要解决的问题,以提升鸢乌贼原料的经济价值。

现今常用的除酸方法主要有：浸泡除酸法[5]、超声波除酸法[6]、碱性精炼[7]等。浸泡除酸法最早用于秘鲁鱿鱼除酸[8],具有成本低廉、对设备及环境要求低、适合大规模商业化生产等特点[9],并且不会对鸢乌贼胴体肌肉品质造成影响[10];超声波除酸法是利用物理波空化动物肌肉纤维细胞、热效应及机械作用等,在鱿鱼加工中已广泛应用[6]。超声波辅助处理缩短秘鲁鱿鱼的除酸时间,增加鱿鱼的持水性和嫩度,改善除酸后秘鲁鱿鱼的质构特性,同时对鱿鱼的色泽无显著影响,在肉质嫩化方面效果显著[11];碱性精炼法通过酸碱中和效果进行除酸,可能对鸢乌贼体内游离氨基酸及主要发酸物质进行中和,以达到除酸效果。目前关于鸢乌贼体内的酸类物质是否会因超声波改变其细胞结构,及碱性液体与鸢乌贼胴体肌肉中多种氨基酸是否生成二次产物都不了解,故选取浸泡除酸法进行除酸处理。磷酸盐常用于食品加工,具有提升肉类保水性、改善肌肉品质等作用[12],在肉类加工时,磷酸盐可提高制品的pH值[13],缓冲效应可增加肉的持水性[14],提升细胞的稳定性,防止细胞失水。在水产加工应用方面,原卫生部已批准将六偏磷酸钠、多聚磷酸钠作为水分保持剂、酸度调节剂、稳定剂等添加到预制水产品中。

目前关于鸢乌贼胴体除酸研究较少。鸢乌贼体内游离氨基酸、核苷酸、meso-丙氨奥品、β-丙氨奥品、牛磺奥品等是鸢乌贼肌肉中的酸味相关物质,其中奥品和有机酸是构成鸢乌贼肌肉酸味的最主要物质[1]。选取对胴体肌肉影响较小、优化胴体肌肉品质、成本低、副产物少的搅拌浸泡法进行除酸,对鸢乌贼胴体除酸剂进行筛选,采用响应面法优化工艺条件,为鸢乌贼胴体肌肉除酸及进一步开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸢乌贼胴体样品由中国水产科学研究院南海水产研究所“南锋号”科考船于2021年6月在中国南海南沙海域捕获。起捕后在-10 ℃环境中冷链运输至实验室,去除内脏、头部、足部及内壳,将完整胴体肌肉分装于自封袋内。所有肌肉样品随机分组标记,放置于-20 ℃冰箱冷冻保存;六偏磷酸钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠,均为分析纯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);Ultra Turrax T25D 型均质机(德国IKA工业设备公司);AvantiJ26XP 高速离心机(美国贝克曼库尔特公司);LFRA-100质构仪(美国Brookfield公司);SC-80C型全自动测色色差计(北京康光仪器有限公司);pH计(上海仪迈仪器科技有限公司);多功能静电冷冻/解冻/保鲜实验机(台湾迪弗斯科技股份有限公司);D5770-01 数字温度计(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 实验方法

为保证数据准确性,所有样品均进行3组平行实验,每组平行测定6次,去除最大值和最小值后取平均值。

1.2.1 鸢乌贼胴体肌肉除酸剂筛选

参考泮凤[5]测定方法,略有修改。将鸢乌贼样品从冰箱中取出置于室温环境中,待样品升温至4 ℃,将解冻后的样品清洗后保留表皮切成约2 cm×2 cm的小块。取10 g胴体肌肉于烧杯中,在室温条件下以1∶3(m/v)的比例完全浸泡于配置好的除酸剂中,每隔1 h对浸泡样品进行1次搅拌,确保浸泡均匀,8 h后捞出用超纯水漂洗沥干随后对其进行各项指标的检测。

1.2.2 鸢乌贼pH测定

参考李桂芬等[15]的测定方法,略有修改。将鸢乌贼胴体肌肉样品切碎后置于50 mL离心管中,加入蒸馏水30 mL,浸泡30 min,以均质仪高速均质1 min,静置30 min后,利用精密pH计测定上清液pH值。

1.2.3 鸢乌贼质构测定

具体测定参数设置为：探头类型选择TA44,夹具选择TA-RT-KIT,测量前速度：3.0 mm/s;测试中速度：1.0 mm/s;测量后速度：1.0 mm/s;压缩程度为30%,两次压缩间隔时间为5 s。

1.2.4 亨特(Hunter)白度测量[16]

将鸢乌贼按照不同解冻方式解冻完成后,用厨房纸吸去表面水分,切分为3 cm ×3 cm大小,置于白色背景板上,用手持色差仪分别测定其L*值、a*值、b*值。测定前用标准白板对色差仪数值进行矫正。每组3个平行试样,结果取平均值,白度值按式(1)计算。

W=100-(100-L*)2+a*2+b*2

式(1)

式中：L*-享特(Hunter)明度指数;a*-亨特(Hunter)色品指数红绿值;b*-亨特(Hunter)色品指数黄蓝值;W-亨特完全白度值越大表示白色程度越高。公式是采用色差原理来衡量白度的即用白点的远近来进行度量。当明度L*为100色度a*、b*均为0时,其白度值为100。

1.2.5 单因素实验

1.2.5.1 除酸浓度的选择

根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760—2014)对添加剂的要求,分别取除酸剂浓度0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L对鸢乌贼胴体肌肉样品进行除酸处理。精确称取10.0 g鸢乌贼胴体肌肉,室温环境中以1∶3(m/v)的料液比除酸8 h,每隔1 h对浸泡样品搅拌1次,确保浸泡均匀,8 h后捞出用超纯水漂洗沥干后对其进行pH测定。

1.2.5.2 除酸时间的选择

精确称取10.0 g鸢乌贼胴体肌肉,在室温环境中以1∶3(m/v)的料液比、0.3 g/L除酸剂浓度分别浸泡 1、2、3、4、5、6、7、8、9 h。每隔1 h对浸泡样品搅拌,确保浸泡均匀,到达浸泡时间后捞出用超纯水漂洗沥干后对其进行pH测定[17]。

1.2.5.3 除酸料液比的选择

精确称取10 g鸢乌贼胴体肌肉,以1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的料液配比,在室温环境中以0.3 g/L浓度的除酸剂浸泡。每隔1 h对浸泡样品搅拌,确保浸泡均匀,8 h后捞出用超纯水漂洗沥干对其进行pH测定。

1.2.6 响应面试验设计

选取Box-Behnken模型试验设计,以除酸剂浓度、除酸时间和除酸剂料液比为3个考察因素,分别以A、B、C表示,各因素设计3个水平,以-1、0、1对自变量的实验水平编码,共17组实验,其中12组为析因点;5组为区域的中心零点。试验设计因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素和水平Tab.1 Response surface test factors and levels

1.2.7 总酸度的测定

参考魏晓敏等[18]对总酸度进行测定,将鸢乌贼样品粉碎为肉糜。取适量的样品,加入少量无二氧化碳的蒸馏水,将样品溶解至250 mL容量瓶中。在80 ℃水浴锅中恒温加热0.5 h,待冷却后定容。用干燥滤纸过滤,收集滤液备用。

1.2.8 样品滴定

准确吸取制备的滤液50 mL,加入酚酞指示剂2～3滴。用0.1 mol/L标准碱液滴定至微红色30 s不褪色。记录用量,同时做空白实验[18]。总酸度按式(2)计算。

式(2)

式中：C1-标准氢氧化钠溶液的浓度,mol/L;V1-滴定所消耗标准碱液的体积,mL;V2-空白所消耗标准碱液的体积,mL;V3-样品稀释液总体积,mL;V4-滴定时吸取样液的体积,mL;m-样品质量或体积(g或mL);K-换算为适当酸的系数。分析乳品、肉类、水产品及其制品时,用乳酸表示其K=0.090。

1.3 数据处理

实验数据采用Excel软件进行数据整理,SPSS 26.0做方差分析及差异显著性分析处理,P<0.05为差异显著,作图利用Origin 2021进行绘制;运用Design-Expert 13对响应面数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 除酸剂筛选

图1为柠檬酸钠、多聚磷酸钠、六偏磷酸钠3种除酸剂间的比较,pH、亨特白度、咀嚼性差异性显著(P<0.05)。在相同除酸条件下,柠檬酸钠的除酸效果显著,经测量南海鸢乌贼胴体天然pH为5.43,除酸后胴体肌肉pH为6.82。鸢乌贼的酸味主要是鸢乌贼肌肉中的有机酸及奥品类物质,柠檬酸钠经水稀释后,部分变成柠檬酸,两者共存于同一体系中。柠檬酸在水中经氧、热、光、细菌以及微生物的作用,易发生生物降解,将发酸物质转变为二氧化碳和水,降低鸢乌贼胴体肌肉酸度。肌肉亨特白度是衡量水产品品质的重要指标,柠檬酸可在一定程度上通过调节pH的方式降低样品的褐变程度,提升色泽[19],通过柠檬酸钠除酸后的鸢乌贼肌肉亨特白度最高可达93.02。咀嚼性是衡量肉类品质的重要指标,在标准范围内,咀嚼性与口感成正相关[20],可能柠檬酸对鸢乌贼蛋白质中肌纤维形成稳定的凝胶网络,结构整齐,组织间隙缩小,咀嚼性随之提高。

图1 脱酸剂对鸢乌贼胴体肌肉酸度影响Fig.1 Effect of deacidifyting agents on the muscle acidity of S. oualaniensiscarcass

经过除酸后的鸢乌贼会改变肌原纤维特性,导致硬度变化,从而影响鸢乌贼胴体肌肉口感[21]。图2表明不同除酸剂浓度对于鸢乌贼胴体肌肉硬度差异性显著(P<0.05),经质构仪检测3种不同碱性除酸剂浸泡、搅拌后的鸢乌贼胴体肌肉硬度均呈现先下降后升高的趋势。这可能是因为鸢乌贼胴体肌肉与钠离子结合,同时与碱处理蛋白分子表面的相反电荷,形成双分子层,增加蛋白分子与水分子的亲和性,水分子结合增多,导致硬度降低,弹性增加[22]。但较高浓度的碱溶液会导致蛋白发生变性,在浸泡除酸过程中鸢乌贼胴体肌肉温度升高,肌肉蛋白分子交互增强,但是胴体肌肉中细胞的持水性与形变能力降低,导致胴体肌肉弹性下降[23]。综上所述,柠檬酸钠相比于其他两种除酸剂更有利于鸢乌贼胴体肌肉除酸。

图2 除酸剂对鸢乌贼胴体肌肉硬度影响Fig.2 Effect of deacidifying agent on muscle hardness of S. oualaniensiscarcasses

2.2 单因素实验结果

2.2.1 柠檬酸钠浓度对鸢乌贼胴体肌肉除酸效果的影响

在室温环境,料液比1∶3,除酸时间8 h的条件下进行单因素实验。如图3所示,随着柠檬酸钠浓度的提升,鸢乌贼肌肉pH呈现先上升后下降再上升趋势,差异性显著(P<0.05)。当无柠檬酸钠添加时鸢乌贼胴体肌肉pH最低,在柠檬酸钠浓度0.3 g/L时pH最低。这可能是由于鸢乌贼正常生理活动时消耗大量氧气、能量、脂肪等,加速自身正常代谢,在肌体细胞中生成乳酸[6,23]。柠檬酸钠添加后络合鸢乌贼胴体肌肉中的Ca2+和Mg2+,失去Ca2+和 Mg2+的肌原纤维释放羧基,细胞液中同种电荷相互排斥导致肌原纤维失去张力,增加了肌原纤维蛋白细胞壁的锁水性,防止汁液流失[20]。这解释了鸢乌贼胴体肌肉酸度升高的原因,证明0.3 g /L浓度柠檬酸钠有良好的除酸效果。

图3 不同柠檬酸钠浓度对鸢乌贼胴体肌肉酸度影响Fig.3 Effects of different sodium citrate concentrations on muscle acidity of S. oualaniensiscarcasses

2.2.2 除酸时间对鸢乌贼胴体肌肉除酸效果的影响

在室温环境,柠檬酸钠浓度0.3 g/L,料液比1∶3的条件下进行单因素实验。如图4所示,随着浸泡时间的增长鸢乌贼胴体肌肉pH快速升高,差异性显著(P<0.05)。浸泡至5～8 h时,pH增长缓慢,在浸泡8 h时,pH达到最高6.84,随后逐渐降低。这可能是鸢乌贼胴体肌肉浸泡在柠檬酸钠除酸液中,形成较大的内外浓度梯度差,导致pH值快速升高。随后柠檬酸钠与鸢乌贼细胞液中的有机酸发生中和反应,pH增长缓慢。浸泡时间超过8 h后,细胞内与浸泡液浓度接近,但细胞无法再次复水。导致细胞萎缩、结合水流失破坏其原有正常蛋白质结构,使鸢乌贼胴体肌肉pH大幅下降。因此选择浸泡时间为8 h进行后续实验。

图4 不同除酸时间对鸢乌贼胴体肌肉酸度影响Fig.4 Effect of different deacidifying times on muscle acidity of S. oualaniensiscarcasses

2.2.3 不同料液比鸢乌贼胴体肌肉除酸效果的影响

在室温环境,柠檬酸钠浓度0.3 g/L,浸泡时间8 h的条件下进行单因素实验。如图5所示,鸢乌贼胴体肌肉pH同样出现先上升后下降趋势,差异性显著(P<0.05)。在料液比达到1∶3时,pH达到6.95。鸢乌贼胴体肌肉pH最低,可能是此时液体刚好没过鸢乌贼样品,柠檬酸与肌原纤维快速结合,降低酸度。

图5 不同料液比对鸢乌贼胴体肌肉酸度影响Fig.5 Effect of different material-to-liquid ratios on muscle acidity ofS. oualaniensiscarcasses

2.3 响应面实验结果

2.3.1 回归方程的建立与分析

根据Box-Behnken模型所设计的试验方案进行响应面试验,试验设计与结果如表2所示。

表2 响应面试验因素和水平Tab.2 Response surface test factors and levels

各个因素的F值反映了此因素对试验指标的重要程度,通过表3能够得出,鸢乌贼除酸程度受3个因素的影响依次为B>A>C,即除酸时间>柠檬酸钠浓度>料液比。模型二次项AB、A2、B2、C2均对鸢乌贼胴体肌肉酸度影响极显著(P<0.01);一次项B、二次项AB交互作用显著(P<0.05);其余项对鸢乌贼胴体肌肉酸度影响不显著。剔除二次多项式中的不显著项,将拟合方程修正为：Y=6.95+0.036 2B-0.062 5AB-0.255 5A2-0.108 0B2-1 030C2。

2.3.2 响应面分析

图6为各因素交互作用对鸢乌贼酸度影响的响应面与等高线图。图6 a显示,在料液比为1∶3的条件下,除酸剂浓度与除酸时间交互作用显著,在除酸时间较短时,鸢乌贼胴体肌肉酸度随除酸剂浓度的增加而增加,达到峰值逐渐下降;由图6 b可知,在除酸时间为8 h时,除酸剂浓度与料液比交互明显,趋势与图6 a相似;由图6 c可知,在除酸剂为0.3 g/L的条件下,除酸剂时间与除酸料液比的交互作用较弱。当固定除酸料液比时,随着除酸时间的延长,鸢乌贼胴体肌肉pH升高,达到峰值后又呈下降趋势;说明料液比对鸢乌贼胴体肌肉酸度影响较小。

通过Design-Expert 13软件,并结合回归模型和响应面图分析得出鸢乌贼胴体肌肉酸度脱除的最佳条件为：除酸剂浓度0.35 g/L、除酸时间7.40 h、液料比1∶2.46。在此条件下,预测鸢乌贼胴体肌肉pH为6.90。

根据响应面分析所得最佳参数,综合考虑实际情况,将工艺条件调整为除酸剂浓度为0.35 g/L、除酸时间7.5 h、液料比1∶2.5,在此条件下重复6次,去掉最大值和最小值。测得鸢乌贼胴体肌肉pH的平均值为6.85,与模型预测值基本相符,证明此模型有效可靠,为鸢乌贼除酸处理最佳工艺。

2.3.3 工艺验证及总酸度对比分析

对鸢乌贼胴体肌肉总酸度进行滴定,在相同条件下进行6次重复实验。经过除酸处理后的鸢乌贼胴体肌肉总酸度均值为6.63°T,高于未经处理鸢乌贼胴体酸度均值4.27°T,品质有较高提升。

3 讨论

通过响应面法对除酸条件的综合优化,分析除酸剂浓度、时间、料液比对鸢乌贼胴体pH的综合影响。通过对3种脱酸剂的筛选,柠檬酸钠作为脱酸剂可络合肌原纤维中的金属离子,具有溶解性好、酸度调节性强、缓凝性强、可防止凝胶生成及对细胞壁通透性维持稳定等特点[25-28],可有效提升鸢乌贼胴体肌肉品质。

随着柠檬酸钠浓度升高,pH值逐渐增大,后趋于平稳最终下降的趋势。柠檬酸钠通过肌原纤维蛋白和胴体肌肉中含有的 Ca2+和 Mg2+的络合作用,使细胞液中失去大量金属离子,肌肉向细胞液中释放羧基[20]。此时由于细胞液中存在大量同种电荷,相互排斥,细胞壁在强烈的排斥作用下锁水性降低、细胞结构松弛,这解释了鸢乌贼胴体肌肉 pH 逐步升高的原因[29]。随着浸泡时间的延长胴体肌肉pH开始下降,出现这种变化的原因可能是浸泡时胴体肌肉内、外浓度梯度差升高,细胞结构破坏,弱碱性溶液与胴体肌肉内酸性物质产生中和反应使pH到达峰值。但在一定时间后,除酸剂的浸泡使得样品的组织结构发生改变、内外浓度梯度差急剧缩小,8 h后内外浓度差趋于平稳,细胞萎缩、结合水流失pH逐渐下降。在整个变化过程中,当反应时间在第8 h时,鸢乌贼胴体肌肉的酸度达到最佳,胴体组织结构也未发生明显的变化。对等量的鸢乌贼胴体样品添加不同体积的浸泡液,随着料液比的上升,样品 pH 和感官评分都呈现先上升,后趋于稳定的变化趋势,料液比的变化对产品除酸效果有着一定程度的影响,但当其料液比达到一定比例时,其对产品除酸效果的影响程度也会降低。综合考虑产品的除酸效果和加工成本问题,可知料液比为1∶3时的除酸效果最佳,该条件下不仅除酸效果良好,除酸剂的利用效率也最高。通过不同的料液比和时间可弥补单一除酸剂在除酸效果上的不足,利用响应面法优化配比和除酸条件,发挥协同作用达到最优除酸效果。但复合除酸剂能否弥补单一除酸剂在除酸作用时间及效果上的不足,能否更好地达到除酸目的,以及复合除酸剂的副产物对胴体肌肉造成负优化,仍需进一步研究[30-31]。

水产品酸度是衡量水产品特殊风味的指标,也可体现水产特殊风味的保持效果。过高表示水产品中有机酸浓度高、微生物数量多,最终导致酸败[32]。经总酸度滴定后,鸢乌贼胴体肌肉酸度均值为6.63°T,高于未经处理鸢乌贼胴体酸度均值4.27 °T。与无任何添加剂的面包酸度5.70 °T、以及新鲜牛奶的酸度17.00 °T相比[33],通过柠檬酸钠处理后的鸢乌贼胴体酸度适宜,除酸率达55.27%,接近预测结果。通过此种除酸工艺的pH平均值为6.85,与天然鸢乌贼胴体肌肉pH 5.43相比,pH值有显著提升,酸度减弱,趋于中性。结果证明本实验优化分析结果扎实可靠。工艺优化后脱除原料中的酸涩风味,并在一定程度上维持了产品的感官品质,提高了产品的商业价值,适合进一步商业加工处理。

4 结论

本研究使用搅拌浸泡法对鸢乌贼胴体肌肉进行除酸工艺处理,以柠檬酸钠为除酸剂,利用Box-Behnken模型响应面分析优化,对鸢乌贼胴体肌肉除酸工艺进行研究。经优化后柠檬酸钠除酸的最佳工艺为：除酸剂浓度为0.35 g/L、除酸时间7.50 h、液料比1∶2.5,此工艺参数下平均pH 6.85,与理论预测值基本相符合,证明了实验模型的可行性。经酸度滴定测量,处理后的鸢乌贼总酸度为6.63 °T,总酸度提升55.27%,具有较好的色泽品质,为后续鸢乌贼胴体肌肉的进一步研究以及鸢乌贼产品开发提供参考思路。