生防菌在棉田土壤中定殖数量与防病作用相关性

王静怡，佐长赓，牛新湘，杨红梅，楚 敏，王 宁，林 青，王有武，娄 恺，史应武,

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830052; 2.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091;3.新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091; 4 新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所，乌鲁木齐 830091; 5 农业农村部西北绿洲农业环境重点实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】棉花黄萎病已成为新疆棉花种植和生产的主要障碍[1,2]。棉花黄萎病是一种土传病害，由大丽轮枝菌通过侵染根部定殖于维管束引起，生物防治在近几年取得了很好的效果，不易使病原菌产生抗病性的特征使生物防治成为了近几年防治方法[3-5]。生防菌能否很好的发挥防病效果受多种因素影响，主要有其施加后在植株或土壤中的适应能力、定殖能力、拮抗物质的产生能力及拮抗基因的表达水平[6]，而生防菌的定殖能力是决定其发挥生防效果的前提[7-10]。棉花黄萎病是一种土传病害，由大丽轮枝菌通过侵染根部定殖于维管束引起。生物防治作为最有前景的防治方法，内生和根际细菌被认为是生防细菌中最有潜力的微生物菌群。研究生防菌在棉田土壤中的定殖数量及其与防病作用相关性，对生防菌在棉花黄萎病的防效具有重要意义。【前人研究进展】WANG等[11]在草莓采收后将拮抗菌接种到草莓果实上，检测到拮抗菌菌群短时间内在草莓果实表面大量富集，病原菌数量明显下降，可能是果实表面有限的空间被拮抗菌生长繁殖所占据，伴随着抑菌功能，病原菌在果实伤口处和表面的生长繁殖被抑制，最终抑制果实的发病 。棉田条件复杂且多变，棉花黄萎病生防菌在实验室条件下对大丽轮枝菌有很好的抑制作用，而在大田中不一定能发挥相同的效果。生防菌剂应用于大田能否起作用主要取决于所施生防菌剂能否在植株根际定殖并增殖[12-13]。其中杜鹃等[14]报道了施加生防菌后根际土壤的细菌数量显著增加，真菌数量显著减少，棉花根际土壤微生物群落结构向有利于作物生长的细菌型转变。娄善伟等[15]也得出相似结论，微生物菌剂滴施后对棉花黄萎病产生了较为明显的抑制作用，发病指数降低，棉花产量随施加药量的增加而增加。【本研究切入点】目前大部分研究放在生防菌与病原菌之间的相互作用使其提高防效上，对生防菌实际应用在土壤中时的定殖与防病相关的研究报道还很少。对于生防菌施入后，棉花黄萎病发病情况与生防菌定殖量的相关性分析还很少见报道，大多都是生防菌和土壤微生物群落的研究。需研究生防菌施入棉田土壤后生防菌的数量变化和棉花黄萎病的发病情况。【拟解决的关键问题】选择4株棉花内生和根际拮抗菌进行盆栽实验，使用平板计数和实时荧光定量分析细菌和病原菌，分析生防菌的定殖与防病的相互关系，为生物防治保障农产品质量与安全生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 土 样

土样取自乌鲁木齐安宁渠试验场灰漠土，土壤理化性质由中国科学院新疆生态与地理研究所胡明芳测定。其中有机质15.2 g/kg，全氮0.868 g/kg，全磷0.667 g/kg，全钾19.8 g/kg，碱解氮0.055 g/kg，速效钾0.288 g/kg，速效磷0.003 g/kg，pH 8.1。

1.1.2 供试病原菌

大丽轮枝菌[16](Verticilliumdahliae)，由新疆农业科学院植物保护研究所馈赠。

1.1.3 供试拮抗菌

4个菌株：分离自博乐和石河子花期棉株体内的BacillusvelezensisBHZ-29、BacillusatrophaeusSHZ-24；分离自石河子花期和苗期棉株根际的BacillussubtilisSHT-15和BacillusvanilleaSMT-24。

1.1.4 棉花品种

新陆早36号由新疆石河子农业科学院棉花研究所馈赠。

1.1.5 供试培养基

NB培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸出粉3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH (7.2±0.2)。

NA培养基：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH (7.3±0.1)。

孟加拉红培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氢钾1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂20 g，孟加拉红0.033 3 g，氯霉素0.1 g。

Czapek’s培养基：NaNO33 g，K2HPO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·4H2O 0.01 g，蔗糖30 g，蒸馏水1 000 mL，pH6.5。

1.1.6 主要试剂

DNeasy PowerSoil Kit(QIAGEN公司)；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生物工程股份有限公司)；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生物工程股份有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 棉苗盆栽种植

将长8 cm,宽6 cm纸片做成纸筒，将经过灭菌处理的土样装至纸筒2/3处，在每个纸筒中种植一粒颗粒饱满的棉种，覆土压实后放置智能培养箱中培养，常温室温培养，昼/夜光照与温度分别：13 h/11 h，26℃/24℃，相对湿度：80%，光照强度60 klx。待接种病原菌后将棉苗移植于大花盆中，每盆移植8株棉苗。

1.2.2 拮抗细菌接种和大丽轮枝菌接种

播种后 18 d左右棉苗一片真叶初现时将SMT-24，BHZ-29，SHT-15，SHZ-24菌株发酵液以10 mL/株(108CFU/mL)均匀灌溉棉苗，对照CK(仅接种大丽轮枝菌)接种同体积灭菌NB培养基，接种后放回智能培养箱培养。第1次接种接抗菌7 d后接种大丽轮枝菌，接种量为10 mL/株(107个孢子/mL)。接种大丽轮枝菌5 d后，第2次接种拮抗细菌发酵液10 mL/株。5 d后第3次接种拮抗细菌发酵液10 mL/株。

1.2.3 拮抗细菌在土壤中定殖数量检测

棉苗土壤第3次接种拮抗细菌10 d后，每10天每种拮抗菌取3份棉苗根部土，混匀后称量5 g的土壤放入装有45 mL灭菌生理盐水的250 mL三角瓶中，25℃，180 r/min震荡2 h，10-4和10-5稀释梯度涂布于NA固体培养基上，30℃恒温培养箱培养1 d。计数统计细菌菌落数在30～300 CFU的平板，每次处理设置3组平行，每组平行计数5次。

1.2.4 qPCR定量大丽轮枝菌

1.2.4.1 大丽轮枝菌DNA的提取

大丽轮枝菌DNA的提取利用真菌基因组DNA提取试剂盒对其发酵液进行提取。提取后的样品保存在-20℃冰箱中待测。

1.2.4.2 qPCR反应体系的优化

参考党文芳等[17]的方法，应用大丽轮枝菌引物Vd-F929-947(5`-CGTTTCCCGTTACTCTTC-3`)和Vd-R1076-1094(5`-GGATTTCGGCCCAGAAACT-3`)对土壤基因组总DNA进行扩增。

1.2.4.3 大丽轮枝菌重组质粒的制备与鉴定

参考党文芳等[17]的方法。

1.2.4.4 标准曲线的建立

参考党文芳和张涛等的方法[17,18]。

1.2.4.5 样品的qPCR检测

用qPCR对扩增后的大丽轮枝菌定量检测，将得到的每个样品对应的Ct值带入上述重组质粒DNA构建的标准曲线方程中，计算棉花根际土壤中大丽轮枝菌的含量(copies/g FRW)。

1.2.5 病情调查

调查第3次拮抗菌接种2 d后发病情况，以棵为单位，统计发病叶片数与每株总叶片数，分级标准如下：0级：外表无症状；1级：病叶占总叶片数25%以下；2级：病叶占总叶片数25%～50%；3级：病叶占总叶片数50%～75%；4级：病叶占总叶片数 75%以上。

病情指数=∑(级值×株数 /(最高级值×总株数)×100。

防治效果=(大丽轮枝菌对照组病情指数-拮抗菌处理后的病情指数)/大丽轮枝菌对照组病情指数×100%。

1.2.6 生防菌定殖数量与防病效果相关性

利用皮尔逊相关系数(PCC)分析生防菌定殖数量与防病效果之间的相关性，PCC分析在SPSS 26软件中进行。

1.3 数据处理

绘图和分析利用Origin 2018和SPSS 26软件进行。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌和大丽轮枝菌在棉花根际土壤定殖数量

研究表明，菌株SHZ-24和BHZ-29在土壤中适应性良好，呈现先减小后增大的趋势；菌株SMT-24和SHT-15在土壤中呈现先增大后减小的趋势。在50 d时，4株菌的定殖数量从高到低的顺序依次为SHZ-24, BHZ-29，SMT-24，SHT-15，在土壤中的数量分别为5.13×107、3.63×107、3.97×107和2.53×107copies/g，且4株菌的数量都大于10 d时的数量。图1

经拮抗细菌处理的土壤中大丽轮枝菌数量均小于CK对照组。在CK组中，土壤中大丽轮枝菌呈现先减小后增大的趋势。4组拮抗细菌处理的土壤中，大丽轮枝菌数量由高到低分别是：BHZ-29，SMT-24，SHT-15，SHZ-24。图2

注:灭菌土壤

2.2 拮抗细菌对棉花黄萎病的防病作用

研究表明，土壤中4株拮抗细菌处理组的病情指数变化均小于CK对照组，且4株菌处理组在整个生长时期内病情指数呈现缓慢增长趋势，增长速度小于CK对照组。50 d时，CK对照、SHZ-24、SMT-24、SHT-15和BHZ-29菌各处理的病情指数分别为22.44，11.7，11.36，12.06和11.39。 图3

注:灭菌土壤A:ck; B:SHZ-24; C:SMT-24; D:SHT-15; E:BHZ-29

2.3 拮抗细菌数量与防病效果的相关性

研究表明，经4株拮抗细菌处理后，SHZ-24、SHT-15、SMT-24和BHZ-29菌株的定殖数量与大丽轮枝菌数量的PCC分别为-0.945、-0.982、-0.963和-0.961(P<0.01)，4株拮抗细菌定殖数量与大丽轮枝菌数量呈负相关且为高度相关。4株拮抗细菌定殖数量与防病效果的PCC值分别为0.938、0.983、0.801和0.851(P<0.01)，4株拮抗细菌定殖数量与防病效果呈正相关且为高度相关。表1

注:灭菌土壤

3 讨 论

土壤中的微生物数量繁多、种类丰富，其中微生物的多样性对土壤的成分组成、土壤中的养分利用情况和植物的生长发育起着重要作用[19-21]。林巧玲等[22]采用灌根和涂叶的方法对盆栽大豆中海洋细菌解淀粉芽孢杆菌的定殖动态进行了研究，指出灌根方法可使该菌株在大豆体内稳定定殖一段时期。祁超等[23]利用GFP标记法测定生防菌在黄瓜体内的定殖情况，得出生防菌可在黄瓜体内稳定定殖且维持在一定数量。王涛等[24-25]通过盆栽试验分析了棉花黄萎病拮抗细菌在土壤、棉花根际和根内的定殖情况，指出拮抗细菌在灭菌土中的定殖数量高于自然土中。

研究中当拮抗细菌施入棉株根部土壤中时，拮抗细菌可在土壤中定殖并增殖。4株菌中SHZ-24菌株在土壤中定殖能力最好，且在生长后期防病效果在4株菌中较好，定殖能力是发挥其防病效果的前提，与前人研究结论相符。经拮抗细菌处理的土壤中大丽轮枝菌数量均小于CK对照组。拮抗细菌施入土壤中后通过竞争和拮抗物质的产生等抑制了大丽轮枝菌的生长。土壤中大丽轮枝菌呈现先减小后增大的趋势。拮抗细菌定殖数量与防病效果相关性分析，发现4株拮抗细菌定殖数量与防病效果呈显著正相关，拮抗细菌的施加量显著影响其在土壤中防病效果的发挥。而生防细菌能否大田应用涉及生防菌的施用方式、施用量、对土壤环境的适应能力、在土壤中抑菌物质的产生能力及与土壤环境中各生物之间的互作能力等。生防菌的大田应用涉及范围广，在土壤中的存活能力只是影响其能否大田应用的其中一个因素，让生防菌应用于大田，还须进行影响其应用全部因素的研究。

4 结 论

构建了实时荧光定量拮抗菌和大丽轮枝菌的标准曲线，对棉花根际拮抗菌和大丽轮枝菌进行了实时荧光定量。4株菌在灭菌土壤中存活数量变化趋势相同，50 d时的存活数量从高到低分别为SHZ-24、BHZ-29、SMT-24和SHT-15，拮抗细菌处理的土壤中大丽轮枝菌数量均小于CK对照组。4株拮抗细菌均降低棉苗的病情指数，其中BHZ-29的防病效果最好。SHZ-24、SHT-15、SMT-24和BHZ-29菌株在土壤中的数量与大丽轮枝菌数量呈负相关，PCC值分别为-0.945、-0.982、-0.963和-0.961。与防病效果的PCC值分别为0.938、0.983、0.801和0.851，4株拮抗细菌在土壤中的定殖数量与防病效果呈显著正相关。