早熟陆地棉种萌发中种胚保护性酶活性对盐胁迫的响应

张红霞，雍晓宇，何 飞，夏 军，李慧琴，王潭刚

(1.石河子大学农学院/新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子 832003；2.新疆生产建设兵团第三师农业科学研究所，新疆图木舒克 843901)

0 引 言

【研究意义】土壤盐碱化是阻碍作物产量增长的主要因素之一，当土壤中盐含量达到0.2%～0.5%时种子出苗困难,大于0.65%时发芽率显著降低[1,2]。棉花具有良好的耐盐性和抗氧化性[3]。新疆灌区盐碱土覆盖面积848×104hm2[4,5]，且因环境、温度以及地理位置的影响，灌区土壤盐渍化面积有所增加[6]。研究棉花耐盐机理，对于新疆早熟陆地棉减轻盐胁迫有实际意义。【前人研究进展】棉花种子的耐盐水平与大麦相当[7]，多分布于干旱盐碱地区，虽然棉花具有一定的耐盐性，但盐分过高也会对其造成伤害[8]，周桃华等[9]认为种子伤害程度与盐浓度有关，种子萌发及幼苗生长耐盐最大适宜浓度为5%，低盐浓度可以促进种子萌发；高盐分则抑制种子萌发。1%的NaCl溶液处理下，辽2230抗盐型品种种子在处理过程中正常发芽，植株的相对含水量较高；而敏感品种则不能正常发芽，即使发芽，幼苗也多出现弱苗、死苗现象，植株的相对含水量低，相对盐胁迫伤害率高[10]。水分是种子萌发的关键，盐浓度的升高导致种子吸水困难，影响种子萌发速率[11]。种子发芽是基于胚的生长，胚的生长则是种子内部所有生理生化系统协调作用的结果[12]。在NaCl溶液处理下，植物体内保护性酶活性与植物抗氧化胁迫能力呈正相关，在盐分胁迫下，盐生植物与非盐生植物相比，SOD，POD，CAT的活性更高，能更有效地清除活性氧，阻抑膜脂过氧化[13]。【本研究切入点】盐胁迫对棉花种子的萌发会造成不良影响，且不同棉花品种对于盐胁迫的抗逆性也各不相同。但是，大多数研究盐胁迫对棉种萌发的影响仅仅局限于种子含水量和相对盐胁迫伤害率，对于种子内部的生理机制的变化，尚缺乏系统研究。需研究不同浓度盐胁迫对早熟棉花种子萌发特性及关键酶活性的影响。【拟解决的关键问题】以2个新陆早棉花品种为试验材料，设置不同浓度的盐胁迫处理，测定种子发芽率、发芽指数以及种子萌发过程中种子活力、种胚酶活性的变化，分析不同程度盐胁迫影响棉种萌发的生理机制，为提高棉花种子耐盐能力及抗盐碱育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

选择新陆早45号和新陆早65号为供试品种。选取籽粒大小一致，成熟饱满的棉花种子，用10%双氧水消毒后无菌水冲洗5～6次后晾干备用；取高温消毒后的培养皿用于试验。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

共设5个处理：0(对照)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%NaCl溶液，设置4次重复，每个重复放置10粒种子，第一阶段：将新陆早45号、新陆早65号种子整齐摆铺在有2层滤纸的培养皿(φ=15 cm)中，每皿摆放10粒种子，加0(对照)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%NaCl溶液至饱和状态，测定不同浓度处理下2品种相对含水量变化，每2 h测定1次。试验前，将每个处理每个重复种子用天平测得重量并记录；第二阶段：将新陆早45号，新陆早65号置于NaCl浓度为0(对照)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%蛭石中(65 g蛭石与90 mL溶液充分混合)，在恒温培养箱内培养，设置白天16 h，28℃；夜间8 h，18℃。测定发芽势(3 d)，发芽率(7 d)。

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 棉种含水量

处理后每隔2 h用万分之一天平分别测定种子重量，测定至发芽并统计，每处理重复4次。

1.2.2.2 发芽率、发芽势、发芽指数、盐害指数和盐害级别

处理3 d、7 d后分别计算发芽种子粒数，每个处理设置4次重复。

发芽率(%)=处理发芽率/对照发芽率×100%；

发芽势(%)=(规定时间内发芽种子粒数/供试种子粒数)×100%；

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt).

式中，Gt为在不同时间的发芽数，Dt为发芽天数。

盐害指数(%)=(对照发芽率 - 处理发芽率)/对照发芽率×100%。

当发芽率大于对照时为无盐害，记为0；盐害级别判定标准为：1 级(盐害指数≤20%)；2 级(20%<盐害指数≤40%)；3级(40%<盐害指数≤60%)；4 级(60%<盐害指数≤80%)；5 级(盐害指数>80%)。

1.2.2.3 过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD) 、丙二醛(MDA)含量

采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性[14]。氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性[15]，采用硫代巴比妥酸显色反应法测定丙二醛(MDA)含量[16]。

1.2.2.4 脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白质含量

参考李合生的方法测定脯氨酸含量[16]，采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量[15]。

1.3 数据处理

采用Excel软件统计数据；SPSS 19.0软件分析单因素方差，用Duncan法(α=0.05)检验显著差异性；采用Sigmaplot12.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对棉花种子相对含水量的影响

研究表明，随NaCl处理时间的延长，0～15 h内棉种相对含水量持续上升，15～60 h逐渐平缓，63 h时相对含水量有上升趋势。新陆早45号种子的相对含水量在不同NaCl浓度下表现为：0.2%比对照的相对含水量高，0.8%相对含水量最低；新陆早65号的不同浓度处理间无明显差异。0～15 h新陆早65号比新陆早45号斜率大，吸水速率大，且相对含水量新陆早65号>新陆早45号。图1

图1 不同浓度NaCl胁迫下2棉花品种相对含水量变化Fig.1 Relative water content of two cotton varieties under different concentrations of NaCl stress

2.2 NaCl胁迫对棉花种子相对发芽率、发芽势的影响

研究表明，与对照相比，新陆早45号种子的相对发芽率随盐浓度增加逐渐下降，0.2%和0.4%浓度NaCl处理下种子相对发芽率均和对照无显著差异。当盐浓度增加至0.6%和0.8%，种子相对发芽率与对照相比下降迅速，分别降低86%和171%，差异显著；新陆早65号棉种的相对发芽率则随盐浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，0.2%、0.4%和0.6%NaCl浓度下，种子相对发芽率均高于对照，其中0.4%NaCl浓度水平时，该处理的相对发芽率较对照增加了28%，盐溶液对种子萌发的促进效果最明显，与对照相比，0.8%NaCl浓度处理下的种子相对发芽率受到较高抑制，且相对萌发率降低42%。

随着NaCl浓度的升高，2个棉花品种的的发芽势均呈下降趋势。与对照相比，NaCl胁迫显著降低了新陆早45号种子的相对发芽势，0.2%、0.4%、0.6%和0.8%4个盐浓度条件下，其相对发芽势分别降低88%、153%、122%和155%，有显著差异；而对于新陆早65号，0.4%NaCl浓度水平下种子相对发芽势较对照升高14%，而当NaCl浓度增加至0.6%水平时，种子相对发芽势受到抑制，与对照相比降低11%，当NaCl浓度继续升高至0.8%时，种子相对发芽势大幅下降，降幅达58%。图2

图2 不同NaCl胁迫下2棉花品种的相对发芽率、相对发芽势变化Fig.2 Comparison between the relative germination rate and the relative germination potential of the two cotton varieties under different concentrations of NaCl stress

2.3 NaCl胁迫对棉花种子发芽指数的影响

研究表明，2品种的发芽指数随NaCl浓度的升高，0.4%后表现出下降的趋势，NaCl浓度在0.4%之前，新陆早65号发芽指数随盐浓度的升高呈先升高后降低，且盐浓度0.2%、0.4%时分别比对照高出8.7%、40.2%；新陆早45号随盐浓度的升高而降低。新陆早65号发芽指数始终高于新陆早45号，在0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%分别高出135.2%、21.7%、25.9%、88.4%和52.2%。图3

图3 不同NaCl胁迫下2棉花品种发芽指数比较Fig.3 Comparison between germination indexes of the two cotton varieties under different concentrations of NaCl stress

2.4 NaCl胁迫下不同棉花品种盐害指数和盐害级别变化

研究表明，NaCl浓度与盐害指数和盐害级别均呈正相关关系，即NaCl浓度越高，盐害指数和盐害级别越高。新陆早45号种子在≤0.6%NaCl浓度处理盐害指数缓慢增加，0.8%浓度NaCl处理时大幅升高，较0.6%浓度处理增加36%。在0.2%～0.6% NaCl浓度范围内，新陆早65号种子的萌发均未受到盐害，即盐害指数均为0，0.8%浓度处盐害指数上升至0.3；在0.2%～0.8%NaCl浓度范围内，不同品种所处盐害级别表现出显著差异，新陆早45号的盐害级别随盐浓度的升高，由2级升高至4级，而新陆早65号在≤0.6%NaCl浓度下处于未受盐害状态，仅在0.8%浓度下，盐害等级为2级。2个品种的耐盐性强弱为新陆早65号>新陆早45号。表1

表1 不同棉花品种盐害指数和盐害级别Table 1 Salt damage index and salt harm level of different cotton varieties

2.5 NaCl胁迫对棉花种子脯氨酸(Pro)含量的影响

研究表明，随NaCl处理时间的延长，2品种棉种内累积的脯氨酸含量均呈现在3～60 h内持续增高且在60 h处达到峰值，其后开始下降，且各处理值均高于对照。随着NaCl浓度的增加，种子内游离脯氨酸含量显著升高；品种间，新陆早45号种子在0.4%NaCl浓度处达到最大值，新陆早65号在0.8%NaCl浓度处达到最大值。相同NaCl浓度胁迫的80 h内，新陆早65号游离脯氨酸含量在0.2%、0.4%、0.6%和0.8%NaCl浓度下较新陆早45号分别高0.7%、1%、21%和41%。图4

2.6 NaCl胁迫对棉花种子可溶性蛋白(SP)含量的影响

研究表明，在NaCl胁迫处理80 h时，种子体内可溶性蛋白含量随着盐浓度的增加有增加的趋势。不同品种在相同盐胁迫下可溶性蛋白含量不同，新陆早45号变化幅度小，0.2%、0.4%、0.6%、0.8%NaCl浓度下，可溶性蛋白含量与对照间无显著差异；新陆早65号在0.2%、0.4%、0.6%、0.8% NaCl浓度下均高于对照，且在0.4%浓度处达到最高值，与对照相比增长近14%，新陆早65号的酶活性最高。在相同浓度盐胁迫下，新陆早65号蛋白含量均高于新陆早45号，在0.2%、0.4%、0.8%NaCl浓度下分别高出10%、12.73%、7.8%，差异显著。图5

图4 不同NaCl胁迫下棉花种子脯氨酸(Pro)含量变化Fig.4 Effects of different concentrations of NaCl stress on proline (Pro) content in cottonseeds

图5 不同NaCl胁迫下棉花种子可溶性蛋白含量变化(80 h)Fig.5 Effects of different concentrations of NaCl stress on soluble protein content in cottonseeds(80 h)

2.7 NaCl胁迫对棉花种子丙二醛(MDA)含量的影响

研究表明，NaCl胁迫处理80 h处，种子体内丙二醛含量随着盐浓度的增加而显著升高，其中新陆早45号增幅较大，且在0.8%NaCl浓度处与对照相比增长达98%，新陆早65号变化较为稳定且变幅较小，0.8%NaCl浓度处丙二醛含量达到最大增幅，增长近16%。在相同浓度NaCl胁迫下，新陆早45号种子丙二醛含量均高于新陆早65号，且在0.2%、0.4%、0.6%和0.8%NaCl浓度下，新陆早45号较新陆早65号分别高22%、20%、10%和63%，差异显著。图6

2.8 NaCl胁迫对棉花种子抗氧化酶活性的影响

2.8.1 对棉花种子超氧化物歧化酶(SOD)活性影响

研究表明，2个品种的棉花种子在处理的80 h内，SOD活性均随着处理时间的延长呈先缓慢增加后快速降低的趋势。不同品种棉花种子SOD活性随着盐浓度的增加变化趋势差异较大，与对照相比，新陆早45号种子各处理随着盐浓度的增加SOD活性呈显著降低；新陆早65号种子SOD随盐浓度的增加呈倒“V”型变化，在0.4%NaCl浓度处达到最高值，0.2%和0.4%NaCl浓度处理下SOD活性与对照无显著差异，0.8%NaCl浓度显著降低了SOD活性。在相同NaCl浓度下，新陆早65号SOD变化较为缓慢且变幅较小，新陆早45号变幅剧烈，处理前60 h在0.2%、0.4%、0.6%和0.8%盐浓度处理下，新陆早65号的平均SOD活性较新陆早45号分别高出15%、19%、2%和13%，新陆早65号种子在盐胁迫时，保护性酶系统发挥的作用较强。图7

图6 不同NaCl胁迫下棉花种子丙二醛(MDA)含量变化(80 h)Fig.6 Effects of different concentrations of NaCl stress on alpodialdehyde (MDA) content in cottonseeds(80 h)

图7 不同NaCl胁迫下棉花种子超氧化物歧化酶(SOD)活性变化Fig.7 Effects of different concentrations of NaCl stress on superoxide dismutase (SOD) content in cottonseeds

2.8.2 对棉花种子过氧化氢酶(CAT)活性影响

研究表明，在NaCl胁迫下，CAT活性随着胁迫处理时间的延长表现出先增加后减小的变化趋势，因品种差异，新陆早45号在盐胁迫处理后40 h内持续增加并于40 h内达到最大值，新陆早65号在盐胁迫处理后60 h内持续增加并于60 h内达到最大值，达到最大值后2品种的CAT活性均开始下降。2品种棉花种子CAT活性随着盐浓度的增加变化趋势一致，均表现为低浓度盐促进和高浓度盐抑制，但不同品种其种子CAT活性对胁迫的适应能力不同，新陆早45号在0.2%NaCl及以下浓度表现为促进CAT活性，在0.4%NaCl浓度及以上表现为抑制，而新陆早65号CAT活性则在0.8%NaCl浓度处表现为抑制。相同NaCl浓度胁迫的80 h内，新陆早65号CAT活性在0.2%、0.4%、0.6%和0.8%NaCl浓度下较新陆早45号分别高29%、39%、35%和9%，新陆早65号棉种相较于新陆早45号清除过氧化氢(H2O2)的能力较强。图8

图8 不同浓度NaCl胁迫下棉种过氧化氢酶(CAT)活性变化Fig.8 Effects of different concentrations of NaCl stress on catalase (CAT) content in cottonseeds

2.9 NaCl胁迫对棉种萌发生理指标参数变异的影响

研究表明，提取了前2个主成分，其中，新陆早45号的2个主成分总体贡献率为66.1%，新陆早65号两主成分累计贡献率达60.7%，对数据组的总变异拥有较高的解释。在第1主成分中，新陆早45号的SP、Pro、MDA和新陆早65号的SP、CAT的权重系数均高于0.450 0，胁迫时间对新陆早45号的SP、Pro、MDA和新陆早65号的SP、CAT有着明显的影响，在第2主成分中，新陆早45号和新陆早65号的SOD、CAT的载荷值较高，SOD、CAT受到盐胁迫的影响较为明显。图9，表2

3 讨 论

棉花具有一定的耐盐碱和耐旱性[17-20]，但盐分过大也会对其产生严重的影响[21-23]。试验结果表明，盐胁迫会影响种子的保护性酶活性从而影响到种子的萌发，并且浓度越高，胁迫表现越明显。

图9 盐胁迫下棉花发芽参数的主成分变异Fig.9 Principal component analysis of NaCl stress and effects on germination parameters in cotton

表2 参数矩阵Table 2 Parameter matrix analysis

张国伟等[21]报道可将发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等作为棉花萌发期耐盐鉴定的指标。试验结果表明，随着盐浓度的增加，棉花种子的发芽率、发芽势、发芽指数呈先升高后下降趋势，盐害指数呈上升趋势，且不同品种间也有差异。低盐浓度对种子发芽率没有影响，但随着盐浓度的增加，种子发芽率增加，而进一步增加盐浓度，发芽率才受到抑制[24,25]。在种子萌发试验中也得到了同样的结论。

氯化钠(NaCl)是土壤中的主要盐，这种盐的较高浓度对植物产生2种主要影响，即渗透和离子效应，其中渗透胁迫使植物吸收水和矿物质的能力最小化[26]。植物体内渗透调节剂主要有脯氨酸、甘氨酸、可溶性多糖和多胺等[27]。当植物受到胁迫时，体内可溶性糖和游离脯氨酸积累增加[28]，试验结果表明，随盐浓度的升高，脯氨酸积累逐渐增高，新陆早65号表现最为明显，结果与郭艳超等[26]对芙蓉种子盐胁迫下的研究结果基本一致，盐胁迫下脯氨酸的大量积累也是其适应盐逆境的防御机制[29]，可作为棉花耐盐性生理指标之一。

膜脂和膜蛋白是植物膜系统的组成部分，当植物受到盐胁迫时，体内会产生大量的氧自由基，即活性氧，从而能够对膜脂的氧化造成伤害。植物体中有一个抗氧化过氧化物酶系统，如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等, 进行协同作用可以共同抵抗盐分胁迫所诱导的氧化伤害。SOD可以催化超氧化物歧化为分子氧和H2O2，这种酶被认为是最有效的胞内酶促抗氧化剂。随着NaCl浓度的增加，幼叶中SOD活性研究一直不断下降[30-31]。而史宝胜等[30]对盐嵩种子的研究发现，处理前期随盐浓度的升高，酶活性增大。研究结果表明，新陆早45号棉种与对照相比，随着盐浓度的增加，各处理的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低；新陆早65号种子SOD活性随盐浓度的增加呈倒“V”型变化，0.2%和0.4%NaCl浓度处理下SOD活性与对照无显著差异，0.8%NaCl浓度显著降低了SOD活性。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的产物，可以反映膜脂过氧化的程度和植物对逆境的反应[31]。张海艳等[32]研究发现，随NaCl浓度不断增加，丙二醛含量也随之升高，且耐盐性越差。试验结果表明，经过80 h的NaCl胁迫处理后，种子体内丙二醛含量随着不同盐浓度的增加而显著升高，其中新陆早45号增幅较大，且0.8%NaCl浓度较对照相比增长达98%，新陆早65号变化较为稳定且变幅较小。

4 结 论

不同浓度盐胁迫对2个棉花品种的发芽势、发芽率、发芽指数有着显著的影响，并且随着盐浓度的增加其抑制作用显著增强。品种间耐盐性强弱为新陆早65号>新陆早45号。随NaCl胁迫处理时间的延长，过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、脯氨酸(Pro)呈现先升高后降低的趋势，而可溶性蛋白(SP)则呈增加的趋势；丙二醛(MDA)含量随NaCl浓度的增加逐渐增加。新陆早45号和新陆早65号的SOD、CAT载荷值较高，SOD、CAT受盐胁迫影响显著。较低的盐浓度可以促进种子的萌发，提高种子内的保护系统中SOD、CAT活性从而降低MDA含量，清除过多活性氧，减少种子伤害并提高耐盐性，但是随盐浓度的增加，活性氧自由基代谢紊乱导致种子萌发受到抑制，不同的品种具有不同的临界盐浓度。