中性粒细胞胞外网状陷阱（NETs）在肺栓塞中的研究进展

钱鸳鸳 余 钊

中性粒细胞胞外网状陷阱（NETs）是由DNA 和组蛋白为骨架而形成的网状结构，以染色质解聚和核颗粒物质释放为主要特征。它作为中性粒细胞杀菌的第二种机制，在多种感染性疾病、自身免疫性疾病及心血管疾病中发挥重要作用[1]。NETs 可通过血小板、红细胞和促凝血因子（如血管性血友病因子）促进血栓形成[2]，也可以通过NETs 组份如无细胞DNA（cfDNA）、髓过氧化物酶（MPO-DNA）复合物等激活内源性凝血途径，促进败血症、小血管炎、静脉栓塞等发生发展，造成严重组织损伤[3]。有动物实验显示，NETs 的特征性细胞外DNA 纤维结构大量存在于小鼠诱导产生的静脉血栓形成中[4]。而近期NETs 在静脉血栓中的作用也逐渐被广泛关注[5]。本文结合近年来NETs 相关基础及临床研究文献，围绕NETs 在静脉血栓形成及肺栓塞中的作用综述如下。

1 NETs

NETs 是中性粒细胞的一种新型杀菌方式，主要通过中性粒细胞激活后释放到胞外，是由DNA 和组蛋白为骨架，中性粒细胞弹力蛋白酶（NE）、MPO、α防御素、抑菌肽LL-37、组织蛋白酶等组成的带有强大负电荷的网状结构，以捕获并杀灭病原微生物。是一种“自杀式”的消灭病原微生物的防御模式，而形成NETs 的过程称为NETosis[6]。NETs 的形成是坏死或细胞凋亡死亡的替代方法。该方式通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶及Raf-MEKERK 途径使中性粒细胞发生染色质伸展，解凝聚，核膜崩解释放DNA、杀菌颗粒等并黏附于解凝聚的染色质上，进而核膜破裂，中性粒细胞死亡，释放NETs。NETs 不仅可以捕获病原体，还可以结合血小板和红细胞，与静脉血栓形成有着密切联系。另外，NETosis 和凝血之间也有联系，主要是因为NETs 上的NE，通过裂解使组织因子（TF）通路抑制剂（TFPI）失活，从而导致促凝活性增加。促凝活性导致血小板活化，活化的血小板可以增强NET 形成[7]。NETs 表现为“双刃剑”的角色，在多数情况下，NETs 的产生对机体固有免疫是有益处的，如能在感染性疾病中防止病原微生物的扩散和起杀灭作用。但最近有研究发现NETs 同样参与人体多种疾病的病理过程，当NETs 生成时会产生大量的自身抗原，若清除不及时，抗原大量堆积，可能诱导机体产生大量的自身抗体，造成自身免疫性疾病[8]。

2 NETs 在静脉血栓形成及肺栓塞中的作用

2.1 静脉血栓形成 血栓形成有三个因素，即血流淤滞、高凝状态及血管血皮损伤，与炎症和感染密切相关；而NETs 是炎症和血栓形成之间的桥梁。血流淤滞由于血管扩张、炎症渗出，使血流减慢，有利于炎症介质和炎细胞聚集引起炎症刺激。静脉血流异常后激活内皮细胞，并与血小板、中性粒细胞和单核细胞协同作用，在完整的静脉内传播血栓[9]。中性粒细胞募集到静脉壁后会被激活形成NETs[3]。NETs 的形成一方面是由于中性粒细胞-血小板间的相互作用，另一方面是因为NETs 激活内源性凝血途径，使其独立于纤维蛋白网络中黏附血小板和红细胞的支架[10]。有研究表明，NETs 可诱导内皮屏障功能障碍并将细胞外固体（ECs）转化为血浆蛋白C 激活物（PCA），从而加剧血栓形成NETs[11]。NETs 通过TF 与凝血因子结合来促进促凝血活性。还可以通过Toll样受体激活炎症，触发静脉血栓形成[12]。由此可见，NETs 与静脉血栓的形成密切相关[13]。

2.2 肺栓塞 肺栓塞是来自静脉系统或右心的血栓栓子阻塞肺动脉或其分支导致急性呼吸和循环障碍的疾病[14]。因肺栓塞的栓子99%为血栓性状，故肺栓塞栓子主要是血栓。肺栓塞的病因是任何可以导致静脉血液淤滞、高凝状态及血管血皮损伤，即血栓形成的三大因素。虽然关于NETs 参与肺栓塞的机制研究尚不完全清楚，但NETs 参与血栓形成的研究近期较为关注，且卓有成效。NETs 与静脉血栓的形成密切相关[13]，进一步可以推断肺栓塞与NETs 也是密切相关的。综上所述，NETs 同样与肺栓塞形成密切相关，但仍需要大量试验证明。而抑制NETs 的形成可减少血栓形成也将成为以后研究的重点，从而进一步减少栓子阻塞肺动脉及其分支的概率，降低肺栓塞的治病率。

3 NETs 对肺栓塞预测及预后的影响

血栓形成包括内源性激活及外源性激活。Von Bruhl 等[15]证明NETs 激活因子XII，导致内在途径的激活。中性粒细胞激活时可增加TF 的产生，并且NETs 还含有丝氨酸蛋白酶（中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G），这会导致组织因子途径抑制剂（TFPI）的蛋白水解失活并促进凝血酶和纤维蛋白凝块的产生。因此，NETs 影响凝血系统的多个方面，导致血栓形成增加。此外，Stavrou 等[16]证明了阻断凝血因子Xll-尿激酶受体（FXII-uPAR）与尿激酶受体（uPAR）肽的相互作用或使用特定的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2（AKT2）抑制剂可显着降低NETosis。而Savchenko 等[17]发现NET 组件，包括H3Cit，主要定位于组织血栓，支持NET 在静脉血栓形成和稳定中的作用。临床研究证明，在过去十年中中性粒细胞成为静脉和动脉血栓形成和进展的重要贡献者，最有可能是通过释放NETs。即与NETs 相关的循环标志物水平可能有助于血栓性疾病的诊断和预后。抑制NETs 形成可以进一步降低血栓形成，NETs 的分解和降解可以增强溶栓作用，提供有希望的治疗选择。另外，通过在不影响止血的情况下减少促血栓形成因素，直接减少NETs 形成可能提供一种更安全的抗凝治疗替代方案。NETs 可以通过循环中cfDNA 水平升高来检测到，表明这种NETs 副产品可能用作诊断VTE 的生物标志物。然而，迄今为止，还没有研究将NETs 或NETs 副产品作为诊断急性DVT 的生物标志物进行评估[18]。有实验证明DVTs 和肺动脉栓塞有血小板和白细胞聚集的区域，这些区域也同样富含细胞外DNA。建立合适的诊断DVT 的生物标记物非常有用，因为现在超声诊断虽然是目前最好的诊断方法，但是有时仍然不可靠[19]。另外，Li 等研究显示，在急性肺动脉栓塞患者中，NETs 和脱脂转化酶（LPA）显著升高，故有可能通过LPA-NETs 信号通路来作为治疗静脉血栓形成的靶点[20]。目前也有研究证明，NETs 相关产物如DNase，是降解DNA 的血清酶，包括DNase1 和DNase1 样蛋白。若他们缺失，不管在血管创伤时，或是由无菌中性粒细胞增多症或败血症引起的NETs 形成，都会致严重的后果，导致全身血管阻塞，器官衰竭和快速死亡。目前，重组DNase1已成功用于液化囊性纤维化（CF）痰液，NE 抑制剂已用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）。所以我们更好地理解参与NETs 诱导的分子和拆除它们的机制有可能成功地改变NETs 的致病潜力[21]。也有研究发现，血小板分泌的高迁移率族框1 蛋白（HMGB1）可促进NETs 形成的因子，它参与核小体稳定和基因表达。活化的血小板与中性粒细胞的附着可能使它们非常接近，以至于分泌的HMGB1 能够通过RAGE、TLR2和TLR4 受体激活中性粒细胞，导致NETosis 的诱导。据报道，HMGB1 也存在于NETs 上，从而刺激巨噬细胞[22]。综上所述，NETs 及其相关产物作为静脉血栓形成或肺栓塞的标志物，能大大提高其的检测率，并做到早期诊断，早期治疗，从而降低死亡率，提高生活质量。另外，对于血栓或肺栓塞的抗凝治疗，出血风险一直是最大的难题，不管是相对安全的利伐沙班或低分子肝素，但若是有减少NETs 或其产物的药物，既不影响止血，又能很好地治疗该疾病，并在早期就很好地识别并治疗。

4 展 望

由于NETs 异质性强，对于其检测有局限性。可通过蛋白质印迹法和ELISA 辅助鉴定NETs。但对于量化检测尚不完善，需要不断探索研究。在治疗方面，有研究显示DNase1、维生素D、靶向B 细胞药物（利妥昔单抗）、补体系统等均可抑制NETs 的形成，因此靶向预防NETs 形成可能成为防止血栓的新方法。另外，通过检测NETs 及其标志物如循环细胞外DNA、MPO 水平和NE 的血浆水平，可预测肺栓塞或静脉血栓形成等疾病，做到早期诊断，早期治疗，从而降低死亡率，提高生活质量。但上述研究结果大部分来自鼠类模型研究，其具有所有固有的局限性。我们仍需要对肺栓塞进行大量研究，特别是针对更精确治疗、预测发生的新型标志物的研究。