家畜胚胎移植技术方案比较研究进展

王立强，吕 静，江中良，苏利红

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西西安 712100）

胚胎移植作为现代动物繁殖的重要技术之一，在家畜品种改良、快速扩繁中发挥着不可替代的作用。胚胎移植是一个系统工程[1]，包括同期发情、超数排卵、胚胎移植和保存等环节，有多种不同的药品和使用方案，且动物本身、药品来源和剂量、季节、营养水平等都会影响胚胎移植效果，从而改变了胚胎移植的成本[2-4]。因此，本文通过概述胚胎移植不同环节操作过程与方法，明晰其优缺点，以筛选操作简单、效果佳、成本低的药品和方案，为胚胎移植项目在畜牧生产中的应用提供理论和实践基础。

1 同期发情

同期发情技术是大规模胚胎移植的重要环节之一，可有效提高受体的移植效率[5]。同期发情程度的高低与移植妊娠率紧密相关，受供体与受体子宫状态的影响，胚胎移植要求供体和受体的发情时间相差不超过24h[6]。诱导母畜同期发情的激素有孕酮（P4）、前列腺素（PG）和促性腺激素释放激素（GnRH）及其类似物等[7]。GnRH 通过促进母牛分泌促黄体素和卵泡刺激素（FSH），降低P4 浓度，导致卵巢中周期性黄体的退化，以利于卵泡的生长发育。一种GnRH的人工合成类似物—布舍瑞林，主要作用于垂体，也被用作同期发情的药品，其具有活性强，半衰期长的特点，是一种新型激素药品。阴道栓（CIDR）类似于“人工黄体”[8]，可在母畜阴道内持续分泌P4，在取出CIDR 后注射PG，可有效提高同期发情效果[6]。

同期发情的方法主要包括一次前列腺素（PG）法、二次前列腺素（PG+PG）法、阴道栓加前列腺素（CIDR+PG）法、阴道栓加前列腺素加促性腺激素释放激素（CIDR+PG+GnRH）法、促性腺激素释放激素加前列腺素加促性腺激素释放激素（GnRH+PG+GnRH）法等。

PG 法：对处于发情周期第10 天左右的供、受体母畜一次肌肉注射PGF2α类似物氯前列烯醇诱导发情[9]。这种方法具有操作简单、方便快捷、成本低等特点，但同情发情率不高。

PG+PG 法：在受体母畜发情周期的任意1d（记作第0 天）注射一次PGF2α或氯前列烯醇后，间隔一定时间再次肌注PGF2α或氯前列烯醇，做好标记并观察发情状况，准确记录发情时间和发情率[6,10,11]。这种方法增加了药品成本和时间，具有一定的可操作性。

CIDR+PG 法：在受体母畜发情周期的任意1d（记作第0 天）放入含有黄体酮的阴道栓，一段时间后取出阴道栓，同时肌注PGF2α[12,13]。这种方法增加了成本，但效果较好。

CIDR+PG+GnRH 法：在受体母畜发情周期的任意1d（记作第0 天）埋植CIDR，一定时间后取栓并肌注PGF2α，2d 后肌注GnRH 当天就可观察发情状况[6]。这种方法操作较复杂，但是效果较好。

GnRH+PG+GnRH 法：在受体母畜发情周期的任意1d（记作第0 天）肌注GnRH，一定时间后肌注PGF2α，2d 后再次肌注GnRH，在当天就可观察发情状况[6,10]。这种方法成本稍低，但是效果较好。

CIDR+PG+E2 法：将在CIDR 放入受体母畜的将阴道内，同时注射E2（雌二醇），一定时间后取出CIDR，同时注射PG 和E2。取出CIDR 的第2 天开始观察发情[12]。这种操作方法程序复杂，成本高，但同期发情效果明显。

2 超数排卵

超数排卵技术的应用大大提高了扩繁效果和胚胎移植效益，是获取优良品种后代的主要技术之一。然而受各种因素的影响，使用不同方案超排处理后获得的胚胎数和可用胚胎数会存在差异。

超数排卵使用的促性腺激素有：FSH、孕马血清促性腺激素（PMSG）和重组FSH（rFSH）等[13]。FSH 半衰期短，无法持续刺激卵巢，常用方案是以递减剂量每12h 注射FSH，连续注射3～5d，工作量较大，人力物力成本大，且易引起供体母畜产生应激反应。PMSG 在体内的半衰期长达96h，会过度刺激卵巢，造成对排卵、受精和胚胎发育的不利影响[14]，因此在牛羊上很少使用PMSG。GnRH 可使促黄体素浓度升高以刺激排卵，在超排处理中使用GnRH 及其类似物可以提高超排效果。rFSH 是通过重组技术对FSH 的结构基因组进行改造，以延长FSH 在体内的半衰期，从而减少注射次数，减轻动物的应激反应和操作人员的工作量，然而目前不同剂量和rFSH 类型的超排效果不稳定[15,16]。

供体母畜的超数排卵方案通常有以下几种：①FSH+PG 法；② FSH+PG+CIDR+GnRH 法；③PMSG+PG 法；④CIDR+FSH+PG 法；⑤一次FSH 法。

（1）FSH+PG 法：供体母畜发情当天记为第0天，在发情周期的一定时间内注射FSH 进行超排处理，采用递减法连续注射3～4d（2 次/d），在第5 和6 次注射FSH 的同时，肌注前列腺素PGF2α[17]，获得可用胚数为4.2 枚。孔雪旺等[9]使用此方案对南阳牛进行超排处理，发现育成牛和经产牛比较适宜的FSH 剂量分别为300、330mg/头。

（2）FSH+PG+CIDR+GnRH 法：在供体母畜发情当天，将CIDR 放置到阴道内，一定时间后肌注GnRH，随后递减法分3d 注射FSH，在最后一次注射FSH 后，取出CIDR 的同时注射PGF2α以诱发排卵。乔海生等[14]采用此方案平均获得的胚胎数为8.8 枚/头。

（3）PMSG+PG 法：在供体母畜发情后的一定时间，肌注PMSG，2d 后肌注PGF2α[17]。但是由于PMSG 的半衰期长，会导致卵巢过度刺激，因此在生产上较少使用此方法。

（4）CIDR+FSH+PG 法：结合CIDR 同期发情处理，将CIDR 放入阴道当天记为第0 天，一定时间后按照递减法连续3～5d 肌注FSH，2 次/d，然后取栓，同时肌注PG。岳成广[6]采用此方法，获得的平均胚胎数和平均可用胚胎数分别为7.11 和4.67 枚。需要注意的是，两次注射PGF2α在时间限制上非常严格，不易把控。

（5）一次FSH 法：由于FSH 半衰期短，1 次注射FSH 无法持续刺激卵巢，超排效果差。可以将FSH 溶于缓释剂中延长其半衰期[18]，Hesser 等[15]采用这种方法获得可移植牛胚胎达到9.6 枚。

3 胚胎采集

要根据不同的物种来确定胚胎采集时间。可采用手术法和非手术法收集胚胎。早期研究中通常用手术法采集胚胎，近年来在大动物上常用非手术法进行胚胎采集，可最大限度地减小对生殖道的损伤，且操作方法相对简单[18,19]。

胚胎采集用液体有杜氏磷酸缓冲液、林格液、布林斯特氏液等。常用的为杜氏磷酸缓冲液，可加入0.4%的牛血清蛋白或1%～10%小牛血清，成本较低且配制简单，已被广泛使用。另外，布林斯特氏液效果也较好[18]。

4 胚胎保存

对获得的优秀胚胎，如果不能一次全部移植，就需要进行保存，其保存方法如下。

（1）传统冷冻法：是在室温下将胚胎放入小分子渗透性冷冻保护剂中，通过平衡后在-5～7℃诱发结晶；再以0.2～2.0℃/min 速度冷冻，在-35～-75℃时浸入液氮，并保存在液氮中。在解冻时以大约250℃/min 进行，在培养或转移前室温下脱冷冻剂[20]。

（2）一步细管冷冻保存法：使用乙二醇或丙二醇作为冷冻保存剂进行胚胎冷冻，冷冻和解冻方法类似于传统方法[21]。在解冻后，需要将胚胎连同冷冻保护剂一起注入母畜生殖道内，不需要解冻液，因此不需要特定的仪器设备，操作简单，是胚胎移植产业化最理想的方法之一。

（3）快速冷冻法：将冷冻速度提高到1250℃/min，使用的冷冻保存液不同浓度的渗透性冷冻保存液混合物。在平衡后，将处于部分脱水的胚胎放入液氮蒸气中熏蒸后浸入液氮中[22]。此方法可能会导致细胞内形成冰晶，解冻时需特别注意解冻速度，如果操作不当会对胚胎造成损伤，冷冻后存活率较低。

（4）玻璃化冷冻法：一种快速简单有效的胚胎冷冻保存方法，通过简化冷冻过程，减少了冷冻前后分步处理的步骤，还不需要冷冻仪器，在近年来运用较多[23]。

5 胚胎移植

胚胎移植包括手术胚胎移植法、阴道穿刺胚胎移植法、非手术胚胎移植法。

5.1 手术胚胎移植法

类似于采卵，可以在右肷部切口，将吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，把胚胎输入子宫角内；也可在腹中线切口，在每侧子宫角分别注入一定数量的胚胎。最后将子宫复位，并缝合切口。移植操作要谨慎小心，防止损伤子宫，对受胎造成不利影响[24]。这种方法通常在小动物上使用。

5.2 非手术胚胎移植法

这种方法通常在牛、马等大动物上使用。移植时，用0.25mL 细管分三段吸入PBS 保存液和胚胎，前后由两个气泡隔开。剪去细管封口端后，借助一定的器械，把吸管推入受体母畜黄体一侧子宫角，并使其深入到子宫角的大弯部[20]。应将胚胎移植到有黄体一侧子宫角的上1/3～1/2 处（子宫角尖端），如有可能越深越好。要求操作人员在短时间内将胚胎移植到位，移植冻胚原则上不超过10min[24]。

5.3 阴道穿刺胚胎移植法

在阴道切一小口，将金属细管穿透子宫壁进入宫腔内，再通过装有胚胎的注射器，将胚胎注入子宫腔内。该方法可避开子宫颈口，以减少对宫口的刺激，但是易粘连[25]。这种方法容易引起母畜阴道损伤，导致炎症发生从而降低妊娠率。

6 小结

作为现代动物繁殖的重要技术之一，胚胎移植也是种质资源创新与利用，提高畜牧业经济效益的重要途径。在胚胎移植的不同技术环节中，采用GnRH+PG+GnRH 法进行同期发情经济实用，效果良好；选用CIDR+FSH+PG 方案进行超排处理效果良好；同时，玻璃化冷冻法是一种快速、简单、有效的胚胎冷冻保存方法，便于在生产实践中推广运用；此外，要根据物种选择不同的移植方法。