组学方法筛选结核病生物标志物的应用进展

张皓博，苏华彬，2，刘蒙达，亓 菲，张研博，范伟兴，孙淑芳，樊晓旭

当前，结核病(tuberculosis)在世界范围内仍是最严重的传染病之一。2020年，WHO报告新发结核病感染病例1 000万，死亡150万(包括214 000名HIV感染者)[1]。据估计，全球结核潜伏感染患者约为17亿[2]。在报告病例中，30个结核病高负担国家的病例占新增结核病病例的86%，印度、中国、印度尼西亚、菲律宾、巴基斯坦、尼日利亚、孟加拉国和南非这8个国家占病例总数的三分之二[1]。此外，结核病还是重要的人兽共患病，尽管一些国家宣布根除了牛结核病，但牛分枝杆菌在大多数发展中国家仍然普遍存在。有研究表明，2009-2019年全球人感染牛分枝杆菌的感染率为12.1%[3]。

结核病诊断方法主要包括涂片检查、细菌培养、PCR、X光、结核菌素皮肤试验(TST)和干扰素-γ释放试验(IGRA)等。这些方法在临床上应用广泛，然而涂片检查的敏感性较低[4]；作为“金标准”的细菌培养耗时较长，通常需3～12周[5]；X光法只能证明受影响器官存在结核病的放射学特征，但无法确诊[6]；PCR和免疫学方法，虽然能够区分大多数非结核分枝杆菌感染和卡介苗免疫干扰，但常因假阳性和假阴性结果影响后续的干预治疗措施[7]。此外，在潜伏感染病例中，由于宿主体内含菌量较低且未表现出明显临床症状，这些检测方法无法判断感染情况，以及发展为活动性结核的风险。因此，需要利用更多的特异性生物标志物，建立有效、快速、灵敏的结核病诊断方法，快速识别感知发病情况并及时采取干预措施。

理想的结核病生物标志物是在潜伏感染、活动性结核以及耐受等不同阶段，可以检测到的特异性生化指标，人们可以通过其水平差异变化，及时做出感染预警。结核病生物标志物主要包括细胞因子、宿主蛋白、microRNA以及结核病原菌成分等。目前，人们所知的用于结核病早期诊断的有效生物标志物还很少[8]，因此需要利用新技术、新方法发现和验证更多敏感、特异的结核感染生物标志物。随着生物信息学的发展，基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等组学方法成为筛选生物标志物的有效手段。本文就组学方法筛选结核病生物标志物的应用情况做一综述。

1 基因组学筛选结核病生物标志物

随着全基因组测序技术和生物信息学的发展，人们将基因组学技术用于筛选结核病生物标志物。最经典的是比较基因组学方法，分析不同病原及病原不同亚种之间的核心基因，鉴定新的标志物。Zhou等比较了4 294个结核分枝杆菌全基因组和14个非结核分枝杆菌全基因组，发现ku基因(又称为mku或Rv0937c)在分枝杆菌基因组中广泛存在，在结核分枝杆菌复合群中高度保守，有望成为区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的生物标志物[9]。

2 转录组学筛选结核病生物标志物

转录组学是通过检测低水平的结核分枝杆菌抗原、识别与结核分枝杆菌感染的免疫表型以及检测宿主RNA和蛋白特征性变化等，确定生物标志物[10-11]。与单一检测方法相比，转录组学评估宿主mRNA变化，能够更全面、更有效的挖掘不同感染阶段生物标志物[12]。过去10年，应用最为广泛的是利用转录组学方法比较潜伏感染、活动性结核患者与健康人群血液中mRNA的变化，根据不同健康状态下基因表达差异，特别是循环系统中免疫细胞基因表达变化及其在血液中相对丰度的不同，确定可能将活动性结核患者与潜伏感染区分开的标志物[13]。

已有研究表明，在无症状个体中，一部分活动性结核病相关转录分子(82个Log2FC>1.5的上调表达基因)，如Fcγ受体1基因FCGR1A(Log2FC=1.334)、丝氨酸肽酶抑制剂成员基因SERPING1(Log2FC=1.511)和补体成分基因C1QC(Log2FC=1.134)，在发展为活动性结核之前，就能够用PET/CT成像技术检测到表达水平差异，这对于疾病预测具有重要意义[14]。对高危人群的研究也表明，生物标志物在转录水平的特征可在出现临床表现1年前，帮助判断发展为活动性结核的可能性[15]。在牛结核病研究中，利用转录组学对结核感染早期和晚期牛血液进行分析，确定了潜在生物标志物，对于了解发病机制和病程进展、制定合理的控制策略至关重要[16]。此外，根据深度测序结果，结合GEO数据库进行分析，也是筛选结核病生物标志物的有效方法，Wen等对肺组织代谢组数据进行分析，并通过ELISA对筛选出的差异基因进行验证，发现CCL5 在健康个体和结核病患者中的水平存在差异(AUC=0.723)，CCL19 在结核病患者和其他呼吸系统疾病患者中的水平存在显著不同(AUC=0.811)，提示上述基因可能成为有效的生物标志物[17]。有研究对肺组织和血液的转录组学数据进行分析，发现结核病患者IRF1基因与健康个体相比，显著上调，提示IRF1基因可能是结核病诊断的生物标志物[18]。

目前，在一些研究中，发现的16个候选生物标志物，如daCosta3包含3个基因用以区分活动性结核与其他疾病，Jacobsen3包含3个基因用以区分活动性结核和潜伏感染，然而这些生物标志物存在一定的局限性，可能只适用于所研究的群体，在2年内，预测结核病进展的敏感性和特异性都低于75%[19-20]，但在活动性结核患者中，转录组学方法在区分活动性结核与健康个体的平均灵敏度为93%，特异性为97%；在区分活动性结核与潜伏感染的平均灵敏度为88%，特异性为85%；在区分活动性结核与其他疾病的灵敏度为82%，特异性为79%[21]。转录组学方法在诊断潜伏感染人群敏感性和特异性不尽如人意，这是由于基因在不同宿主体内表达有所差异，且结核病发病机制复杂，例如免疫功能低下人群，血液中基因的转录水平可能不同。此外，其他疾病共感染也会影响转录组学方法的特异性，例如，干扰素上调表达是结核病感染的主要特征，同时也是HIV感染的重要信号[16]。尽管如此，利用转录组学筛选生物标志物预测结核病进展依然是有效的方法之一，但操作需要进一步简化。Cepheid等公司正在开发通过GeneXpert平台实时监测宿主mRNA丰度的试剂盒。一旦成功，就可以用于临床预测判断结核病进程。

3 蛋白组学筛选结核病生物标志物

检测血清中生物标志物是疾病诊断的有效手段[22]。结核分枝杆菌入侵机体后，可以改变不同蛋白的表达，并通过不同途径将抗原蛋白释放到血液中，使宿主产生相应抗体[23]。然而，由于结核病抗原多样性和复杂性，结核病患者体内抗体表现出极大多样性。因此，传统血清学方法在检测多种结核分枝杆菌抗原时敏感性和特异性不尽如人意。蛋白组学筛选结核病生物标志物不是针对结核分枝杆菌单个抗原的抗体，而是囊括并分析血清中所有蛋白质，包括结核分枝杆菌相关蛋白。因此，可利用蛋白组学筛选血清中结核病生物标志物对结核病作出有效诊断[24-25]。

许多研究已利用蛋白组学技术比较分析结核病患者和健康个体的蛋白质水平差异。基于质谱(MS)、磁珠与质谱相结合、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)等强大的蛋白质组学技术，研究人员在血清蛋白质中发现许多差异表达的蛋白，这些蛋白参与免疫反应、脂质代谢和组织修复等[26-28]。此外，鉴于艾滋病和结核病合并感染情况，研究人员利用蛋白组学技术在血清中成功发现除干扰素外艾滋病单一患者与合并感染患者血清中的25种差异蛋白，这些蛋白参与宿主免疫反应过程，最主要的是一种候选蛋白内皮糖蛋白 (ENG)，在艾滋病合并感染患者种，iTRAQ法增加了4.9倍，ELISA法增加了11.5倍[24]。这些蛋白有可能成为结核病诊断的血清生物标志物。在牛结核病研究中，Mazorra-Carrillo等使用2D-GE和LC-ESI-MS/MS方法筛选血清生物标志物，发现健康牛中伯胺氧化酶、补体C5和血清转铁蛋白表达水平高于患病牛，诊断灵敏度达70%以上，特异性80%以上，表明这些蛋白质有望成为牛结核病诊断新的生物标志物[29]。

不仅在血清样本中，人们利用蛋白组学在其他样品中筛选出结核病生物标志物。在尿液中，Wang等利用二维电泳、高效液相色谱与电喷雾质谱相结合的方法，从结核病患者和健康对照中鉴定出19个差异表达的尿蛋白[30]。无独有偶，通过iTRAQ标记脑脊液样品进行LC-MS/MS分析，发现神经表皮生长因子(NELL2)过度表达，并证明其是潜在的结核病诊断生物标志物[31]。

4 代谢组学筛选结核病生物标志物

过去10年，代谢组学已成为探索和识别新生物标志物的有效方法。代谢物是各种生物过程的最终产物，一定程度上能够反映上游的生物事件，如基因突变和环境变化等。通过提取痰液、血液、尿液样本中代谢物，发现结核病患者的许多生物过程相比健康个体出现异常和紊乱，特别是患者能量消耗、糖酵解、脂肪分解、氨基酸代谢和核苷酸生物合成过程[32-33]。研究表明，结核病患者与潜伏性感染者、健康个体相比，氨基酸代谢发生明显变化[34]，1-甲基组氨酸、乙酰乙酸、丙酮、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、乳酸、赖氨酸、烟酸、苯丙氨酸、丙酮酸和酪氨酸的浓度增加，同时丙氨酸、甲酸、甘氨酸、甘油磷酸胆碱的浓度降低。

然而，不同代谢组学研究筛选的生物标志物存在较大差异，无法彻底解释和区分结核病引起的代谢途径和信号通路变化，这些生物标志物检测的特异性较低[35]，且不同生物样本得出的研究结果也存在差异。此外，结核病引起的代谢水平变化，也可能由其他疾病导致，这些生物标志物很少通过其他组学进一步验证，重复性较差，可信度较低。因此，需要运用多种组学方法综合分析，严格设计验证结核病生物标志物，全面揭示结核病发病机制。随着系统生物学和生物信息学的发展，人们整合代谢组学和转录组学方法分析血液中结核病生物标志物，例如，研究人员利用LC-MS方法分别分析了活动性结核和健康个体血液中的代谢图谱，接下来将代谢组学数据与转录组学数据在诊断和药物敏感的整个治疗过程中进行整合。N-乙酰神经氨酸在诊断时的AUC为0.66。喹啉在治疗1个月后的AUC为0.77，吡哆醇在治疗成功完成后的AUC为0.87[36]。这表明不同组学的整合进一步提高了实验结果可信度。

5 展 望

及时有效诊断和干预对于结核病防治至关重要，结核病生物标志物有助于了解疾病发病机制，实现早期诊断。迄今为止，有关结核病生物标志物的研究超过9 000项[10]，然而大多数生物标志物经初步筛选无后续详实的验证。尽管组学方法是筛选新结核病生物标志物的有效手段，但由于很多疾病与结核病有相似的生物学变化，生物标志物的敏感性或特异性仍有待提高。此外，通过单一组学方法和不同类型样本得到的结核病生物标志物也不足以完全阐明结核病发病机制，目前尚未鉴定出高特异性的结核病生物标志物。

WHO标准规定理想的生物标志物敏感性应大于90%，特异性大于70%[37]。然而，在早期许多结核病生物标志物相关研究中，样本量较低。目前结核诊断生物标志物主要为血液中C反应蛋白(CRP)、尿液中脂阿拉伯甘露糖(LAM)和痰液中结核分枝杆菌及利福平耐药基因(MTB/RIF)。虽然CRP检测特异性相对较低，但仍可用于社区筛查[38]，尿液LAM敏感性不高，无法用于筛查，但可用于HIV阳性患者结核病诊断，且操作简便[39]。痰液Xpert检测具有高特异性和高敏感性，但在初筛时，不同痰液样本基质成分会影响诊断敏感性[40]。组学的发展使高通量筛选结核病生物标志物成为可能。多组学整合可进一步验证并提高生物标记物的可靠性。虽然目前尚无理想的结核病单一生物标志物，但相信通过多种方法综合筛选验证，未来将有单一或多种生物标志物组合用于不同场景下结核病诊断。

利益冲突：无