酶联免疫吸附法检测猪肉中喹诺酮类药物步骤及注意事项

任艳娥

（朝阳县畜产品安全监察所，辽宁 朝阳 122000）

喹诺酮类药物常见的有洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等4种原料药的各种盐、脂及其各种制剂，是由人工合成的一类广谱抗菌药，对呼吸道疾病具有很好的治疗效果，对厌氧菌、衣原体等也具有一定的作用，此类药在2016年前被广泛应用在畜禽、水产等养殖环节中，后经过相关专家的研究考评发现此类药化学性质稳定，半衰期长，人类在食用了含有喹诺酮类药物的动物相关产品后会在其体内蓄积，可引起耐药性和潜在的致癌性，对人类身体健康产生一定危害，从而引起社会的广泛关注。因此2016年1月1日国家已经明文规定在所有养殖环节中全面停用喹诺酮类药物（洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等4种原料药的各种盐、脂及其各种制剂）。

2012年以来，酶联免疫吸附法成为辽宁省各县区实验室快速筛查动物产品及组织中喹诺酮类药物残留的主要检验检测技术手段，此方法快速便捷、灵敏度高、易操作、受环境因素影响相对较小、成本相对较低等特点，适合广大基层实验室大批量的筛查检验，因此受到县一级检测机构的青睐。酶联免疫吸附法操作简单其反应原理浅显易懂，样品中的喹诺酮类药物和试剂盒酶标板上固定的抗原进行特异性竞争抗体，加入酶标记物，再加入底物，底物受到催化显色，然后根据显色的深浅莱判断样品中奎诺酮类药物的含量，显色越深含量越少，反之显色越浅含量则越多。笔者从事化验室残留检验检测多年，在实际操作中积累了一定的惭怍经验，下面将以检测猪肉中喹诺酮类药物为例简述检验检测相关步骤及其注意事项。

1 样品的前处理及注意事项

使用试剂盒前，仔细阅读说明书(本文使用的是北京维德维康生物技术有限公司生产的喹诺酮类酶联免疫试剂盒Ⅳ型96孔）。不要使用过了有效期的试剂盒，试剂盒应在冰箱冷藏环境中存放，不同批号试剂盒中的试剂不得混用，稀释或掺杂使用会引起灵敏度、OD值变化，最后导致结果的不准确。试剂盒使用前，需将盒内各组分及待检测的猪肉（肌肉部分）样品置于实验台上恢复至室温（25±2℃）（提示：约2小时），室温如果低于25℃或试剂及样本未回到室温（20～25℃），会导致后面的OD值偏低，反之则偏高。应避免使用金属类物质盛装和搅拌试剂。各试剂在使用前请轻轻摇匀，混合时应避免出现气泡。在酶标板空中依次加入标准品溶液、酶标记工作液、抗体工作液、AB混合液、终止液的各操作步骤不得超过3分钟。在操作过程中，应尽量避免酶标板上方的空气流动，尤其注意空调的风不能直吹。

检测过程中所用的枪头为一次性使用，不得重复利用。需按比例配比的工作液要求配比。

样品的前处理：（1）在电子天平上准确称取2±0.05克均质后的样品于50毫升离心管中。（2）依次加入0.1毫升磷酸溶液（分析纯2毫升浓磷酸加入98毫升去离子水混匀）、6毫升乙腈，立即充分涡动2分钟。（3）离心机4000转以上，至少离心5分钟。（4）在离心后的离心管中取2毫升上清液于新的4毫升离心管中。（5）在通风橱内，60～70℃水浴锅中，针头距离液面上方0.5～1厘米用氮气吹干。（6）加入1毫升正己烷（在通风橱内操作），充分涡动30秒，再加入0.5毫升样品复溶液（1份浓缩样品+3份去离子水制成），低速涡动30秒。（7）再到离心机上4000转以上，离心5分钟。（8）完全弃去上层正己烷及中间层杂质。（9）取50微升上清液，加入到450微升样品复溶液中，充分涡动30秒。（10）取50微升进行检测（注意：切勿吸到上层杂质）。

2 检测步骤及注意事项

将板条插入酶标板架上，并记录下所有标准品和样品的位置，建议均做双孔以上平行，未使用的板条用自封袋重新密封后，立即保存于冰箱冷藏2～8℃环境中记录好日期；标准物质和无色的发色剂对光非常敏感，因此要避免直接暴露在光线下。用微量洗液枪吸取50微升各标准品工作液及样品溶液分别加入到对应的标准品和样品孔中。注意事项为，移液器吸取液体时应遵循快洗慢打的规则，建议采用吸二打一方式，可有效避免气泡的产生，枪头不要插到液面以下，也不要碰到孔壁，枪头为一次性使用，不能重复利用。有条件的化验室可使用多道移液枪在每孔中加入50微升酶标记物工作液，再在每孔中加入50微升抗体工作液。注意事项：标准品、酶标记物、抗体一定要按顺序添加，枪头也为一次性使用。盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10秒，注意此过程不要将板内液体震出板外，以免临孔样品被污染，充分混匀后，室温下（25±2℃），避光反应40分钟。轻轻揭开盖板膜，寻迅速倒掉板孔中液体，在每孔加入260微升洗涤工作液（1份浓缩洗涤液+19份去离子水混匀制成），充分洗涤4次，每次浸泡15～30秒；有条件的机构建议购买自动洗板机，洗3次即可，省时省力，需注意的是，每次倒掉板内液体时动作需快速，迅速翻转，同时注意临孔避免样品交叉污染，影响到检测数据。倒掉板孔中液体后，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干，如孔内有气泡应用干净的枪头搓破，不同的孔需更换枪头，然后立即在每孔中加入 100微升的A、B混合液。注意事项：底物A液、底物B液应按比例1∶1混合，必须充分混匀，混合液应在5分钟内用完，避免使用金属盛装、搅拌试剂，显色液若有颜色变化表明变质，应当作废。盖好盖板膜，用手轻轻振荡酶标板10秒，充分混匀，室温下（25±2℃），避光反应10～15分钟；揭开盖板膜后，在每孔中加入50微升终止液，轻轻振荡酶标板10秒，充分混匀；注意反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤和衣服，如不小心喷溅到皮肤上应立即用清水冲洗干净，严重者立即就医。加完终止液后5分钟内用酶标仪在双波长450纳米、630纳米下读取酶标板吸光度值，连接打印机打出检测数据，当标准品吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质，此次操作失败，同一样品OD值相差不能超过0.2，反而该样品得重新做。利用试剂盒专用分析软件进行结果分析，操作简便，结果计算更加准确，更适用于大批量样本的快速检测分析，计算过程中应注意往软件输入数据时认真填写，保证数据的输入的准确性并需由另一名检测人员进行认真校对后出具检测报告，确认无误后签字。整个操作过程需要检测人员尽职尽责，每个环节紧密相连，严格按规程操作，是保证数据准确可靠的必要条件。