哮喘患儿Toll样受体4基因多态性及其与哮喘发病的关系

杨雪娇，白宝鑫，柯盈月

1 湖北省十堰市妇幼保健院检验科，湖北十堰 442000；2 湖北医药学院药学院

支气管哮喘（以下简称哮喘）是以气道慢性炎症为特征的一类异质性疾病，发病与气道高反应性有关［1-3］。近年，我国儿童哮喘的发病率逐年增加［4-5］。研究［6-8］显示，哮喘的发生发展可能与基因、环境因素密切相关。Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是模式识别受体（PPRs）的一种，具有单个的跨膜蛋白，参与非特异性免疫（天然免疫）和特异性免疫［9-11］。TLR4是TLR家族成员之一，可识别细菌细胞壁中的脂多糖（LPS），参与调节人体Th1/Th2平衡，调控体内血清白细胞介素-6（IL-6）、γ干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）水平［12-13］，参与哮喘的发生、发展。TLR4基因多态性可能从遗传层面上决定不同个体对感染诱发炎症反应强度的差异性，最终影响疾病的发生。目前TLR4基因多态性与哮喘发病的关系尚不明确。为此，我们分析哮喘患儿TLR4基因多态性，探讨TLR4基因多态性与支气管哮喘发病的关系，旨在为儿童哮喘的诊疗提供新的思路。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019年4月—2022年10月湖北省十堰市妇幼保健院收治的哮喘患儿172例（观察组），其中男88例、女84例，年龄（8.3 ± 1.8）岁，BMI（8.3 ± 1.8）Kg/m2；均为汉族人群；根据≥6岁儿童哮喘急性发作严重度分级［6］将哮喘急性发作严重程度为轻度34例、中度35例、重度45例和危重58例。纳入标准：①年龄6～14岁；②符合儿童支气管哮喘规范化诊治建议（2020年版）［14］诊断标准；③排除患恶性肿瘤、艾滋病、慢性肝肾疾病、自身免疫性疾病或入院前1个月内接受免疫治疗、抗炎治疗及放化疗的患者。另选择同期在医院儿童保健科门诊体检的儿童136例为对照组，对照组男65例、女71例，年龄（8.1 ± 1.5）岁，BMI（18.8 ± 3.2）Kg/m2，均为汉族人群。两组性别、年龄、BMI等资料具有可比性。本研究通过十堰市妇幼保健院伦理委员会审查，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 试剂及材料 DNA提取试剂盒及PCR试剂盒购自购自宝生物工程（大连）有限公司，引物设计及合成购自上海生工生物工程公司。

1.3 两组外周血TLR4基因检测及分型 采集两组外周静脉血3 mL，置于乙二胺四乙酸二钾（EDTA-2K）真空抗凝管。取细胞，按照DNA快速抽提试剂盒说明进行操作，快速抽提全血基因组DNA，Nano-Drop分光光度计检测提取样本的吸光度值，A260/A280介于1.6～1.8，采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应检测TLR4基因。共检测TLR4基因2个SNP位点，其中Asp299Gly（A/G）上游引物5'-GATTACCATACTTAGACTACTACCTCCATC-3'，下 游 引物5'-GATCAACTTCTGAAAAAG CATTCCCAC-3'，引物长度249 bp，内切酶Ncol；Thr399Ile（C/T）上游引物5'-GGTTCCTCTTCTCAAAGTGATTTTGGCAGAA-3'，下游引物5'-CCTCAACACTGGAGAGTGAGTTAAATGCT-3'，引物长度406 bp，内切酶Hinf-Ⅰ。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次，72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用限制性内切酶酶进行酶切，酶切产物在3.5%的琼脂糖凝胶上电泳，Bio-Rad凝胶成像系统判断样本基因型。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料以表示，比较用t检验；应用拟合优度χ2检验分析TLR4基因分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，χ2检验分析样本等位基因及基因型频率分布差异，采用二元Logistic回归分析不同TLR4基因位点基因型的儿童哮喘发病的危险性，将TLR4基因Thr399Ile位点CC型赋值为1、CT型赋值为2、TT型赋值为3，计算哮喘发病的相对危险度OR值。P＜0.05代表差异具有统计意义。

2 结果

2.1 两组TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位点基因型和等位基因频率比较 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位点的SNPs的预期基因型频率处于哈迪-温伯格平衡（HWE），样本具有群体代表性。观察组TLR4基因Asp299Gly位点的基因型AA、AG、GG分别为67、74、31例，等位基因A、G分别为 208、136例，对照组分别为57、54、25、168及104例。两组TLR4基因多态性位点Asp299Gly的基因型和等位基因频率差异没有统计学意义（χ2分别为0.372、0.108，P均＞0.05）。观察组TLR4基因Thr399Ile位点的基因型CC、CT、TT分别为31、73、68例，等位基因C、T分别为135、209例，对照组分别为42、60、34、144及128例。两组TLR4基因多态性位点Asp299Gly的基因型和等位基因分布具有统计学意义（χ2分别为10.19、11.501，P均＜0.05）。与对照组比较，观察组TLR4基因Thr399Ile位点T等位基因分布频率高（P＜0.05）。

2.2 不同TLR4基因Thr399Ile位点基因型儿童哮喘发病的危险性 与CC基因型比较，TLR4 Thr399Ile位点TT基因型儿童患哮喘的危险性高［OR=2.353（95% CI1.575～4.663）；P＜0.05］；与CC基因型比较，TLR4 Thr399Ile位点TT + TC基因型儿童患哮喘的危险性高［OR=1.962（95% CI1.228～3.206）；P＜0.05］；与CT + CC基因型比较，TLR4 Thr399Ile位点TT基因型儿童的患病危险性高［OR=1.875（95% CI1.258～3.059）；P＜0.05］。

3 讨论

支气管哮喘是儿童比较常见的慢性呼吸系统疾病之一，哮喘的主要临床表现为气喘、呼吸急促、胸闷和咳嗽等呼吸道症状，并伴有可 变的呼气气流受限，影响儿童的生长发育。大量研究表明［15-16］，哮喘发病取决于各种易感基因与环境因素之间的相互作用，包括空气污染、过敏原和遗传变异更准确地了解基因突变与哮喘之间的关联有助于开发新的治疗靶点和预防策略，从而降低重症哮喘相关的发病率和病死率。

TLRs是一类跨膜模式识别受体发挥作用的非催化受体，在炎症和肿瘤发生中起重要作用。目前在人类及哺乳动物中已发现11个TLRs家族成员，其中了解比较清楚的是TLR2、TLR4、TLR5和TLR9。TLR4基因位于染色体9q32-q33。TLR4作为跨膜受体，可通过识别病原体相关分子模式（PAMPs） 和损伤相关分子模式以及刺激下游信号通路导致炎症细胞因子和趋化因子的释放来调节免疫系统。TLR4在宿主与入侵病原体和先天免疫之间的相互作用中起着至关重要的作用。TLR4识别细菌外膜中的脂多糖（LPS），LPS在调节包括哮喘在内的气道过敏性炎症性疾病中起重要作用。TLR4通过触发先天性和获得性免疫来对抗细菌感染。TLR4在与LPS 结合后被激活，一系列下游磷酸化和去磷酸化事件最终导致调节炎症因子的转录因子激活，包括干扰素、肿瘤坏死因子和白细胞介素，其还诱导抗原呈递细胞成熟并促进 Th0 向Th1 转变［17］。活化的TLR4可以直接或间接影响调节性T细胞的功能，从而影响Th1/Th2 失衡，诱导哮喘的发生和发展，并影响患者体内内的细胞因子水平IL-4和IFN-γ水平。IL-4和IFN-γ是哮喘中免疫和炎症反应发展的关键细胞因子，在过敏性哮喘的发病机制中起关键作用。IL-4主要由活化的Th2 细胞产生，对于驱动T细胞分化为Th2细胞至关重要。Th2细胞释放免疫球蛋白和IL-4，激活嗜酸性粒细胞、肥大细胞和炎症细胞，进一步降低Th1 细胞免疫反应并减少IFN-γ分泌，从而削弱对Th2免疫反应的抑制并导致慢性气道炎症［18-19］。IFN-γ是参与过敏性哮喘的主要促炎细胞因子，在中性粒细胞和嗜酸性粒细胞向肺部募集中起关键作用。因此，TLR4 在哮喘的发生发展中具有重要作用，但是关于 TLR4 基因多态性与哮喘易感性的研究较少。

我们前期对172 例符合纳入标准的哮喘患儿的临床资料展开研究。从基因水平检测发现，TLR4 基因多态性位点Asp299Gly 的基因型和等位基因分布差异不明显，未显示出其于儿童哮喘的明显相关性； Thr399Ile的基因型和等位基因分布在显著差异，Thr399Ile 位点的基因多态性与儿童哮喘存在相关，进一步采用二元Logistic回归分析发现，Thr399Ile位点TT 基因型是儿童哮喘易感的独立危险因素，CC基因型为哮喘的保护基因。本研究纳入样本量较小，且并未进行多因素的分层分析，地域不同，种族差异，哮喘的表型不同可能会导致在不同的地区出现不同的结果。支气管哮喘的机制是复杂的，在导致支气管哮喘发生的过程中，还有待进一步发现和研究，以便从基因多态性的的角度来寻求新的视野，对支气管哮喘的发生机制和免疫治疗方面找到可利用的价值。

综上所述，哮喘患儿 TLR4 基因Thr399Ile 位点的基因型主要以TT 为主，T 等位基因分布频率高。哮喘患儿TLR4 基因Thr399Ile 位点基因多态性与儿童哮喘的发病相关。这提示TLR4与哮喘有密切关系，为阐明哮喘发生发展的机制提供了依据和思路，为哮喘的诊疗提供了一定理论基础。