海南长花龙血树叶的主要蛋白鉴定及其功能分析

何璇 黄宇昕 吴茂霞 焦晚琪 赵振东 何文英

（1. 海南师范大学化学与化工学院 海南海口 571158；2. 海南师范大学/热带药用资源化学教育部重点实验室 海南海口 571158；3. 海南大学/分析测试中心 海南海口 570228）

长花龙血树（Dracaena angustifoliaRoxb.）属百合科（Liliaceae）龙血树属（DracaenaVand.exL）植物，该属植物某些物种茎部位的树脂成分是传统药物“血竭”的重要来源，而血竭是我国传统名贵中药，在我国境内发现的、有野生分布的血竭基源植物只有海南龙血树和剑叶龙血树2种，其性平、味甘、温、咸，具有良好的活血散淤、定痛止血、生肌敛疮等功效。海南黎族民间用长花龙血树根煮水喝，用作凉茶；叶煮水喝，治疗胃痛、腹痛[1-2]。现代研究表明，龙血树植物茎含有黄酮类、酚类、三萜及其皂苷等化学成分[1]，叶片含有黄酮类、阿魏酸酰胺、松脂醇、甾体等化学成分[3]，药理活性表现出抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗血栓、止痛止血等作用[1,4]；最新报道血竭在抗氧化、抑制细胞凋亡、促进神经细胞再生、辅助治疗并发症等神经退行性疾病方面的治疗潜力[5]。从查阅文献看，国内外对长花龙血树的研究较少且多集中在其茎中植物化学成份提取及其生物或药理活性的研究[1-5]，对其叶片的研究则更少，尤其是海南龙血树作为“血竭”的重要来源，其同生的叶片作为一种亟待开发研究的植物资源，值得引起广大学者的关注。

本课题组的研究方向之一是海南药用植物的蛋白质组学分析，前期研究就发现，某些植物蛋白也具有一定药用功能[6]，可从生物大分子的角度结合其中的小分子化学成分，补充并从整体阐释药用植物的物质基础，有利于更好地实现中药现代化。基于以上多种原因，虽然有较多关于龙血树属植物化学成份提取及其生物或药理活性的研究，但还未见有长花龙血树叶的蛋白提取及其指纹图谱的建立或其中关键蛋白发现分析的报道。作为一种有良好生物及药理活性的植物药，研究其所含植物蛋白名称、发现与其药物活性相关的关键蛋白，对进一步深入开发、利用长花龙血树叶具有非常重要的实践及理论意义。基于双向电泳的蛋白质组学技术结合生物质谱分析具有分辨率高和可重复性好的特点，是目前分析蛋白质的主要工具之一[6]。本研究选择海南地道产长花龙血树叶作为研究对象，利用蛋白质组学技术，首次获得其蛋白指纹图谱及高表达的蛋白，并对质谱鉴定的蛋白功能进行了初步分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 长花龙血树叶样品 样品采集于海南省定安县白石岭公园（经度：110.323959，纬度：19.699211），经海南师范大学生命科学院的陈玉凯副教授鉴定确为长花龙血树叶。

1.1.2 仪器及试剂 仪器及试剂：台式恒温振荡器（精宏）；QL-866涡旋混合器；SIGMA3-18K低温超速离心机（德国SIGMA）；超纯水系统（上海和泰）；EYELA摇床（东京理化）；蛋白质等电聚焦仪(Ettan IPGphor3)，固相 pH 梯胶条（pH=3-10）；Image scanner III扫描仪（美国通用公司GE Healthcare）；ImageMaster5.0凝胶图像分析软件；MultiTemp IV 恒温循环器；UV-2700 紫外分光光度计（日本岛津）；KQ2200E型超声波清洗仪（曙峰企业）；GM-0.33A型隔膜真空泵（津腾）；Voyager-DE PRO ABI4700时间飞行质谱仪（美国ABI公司）。

所有试剂均为国产分析纯试剂。所有实验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 样品处理及蛋白提取 （1）样品预处理：采集回来的长花龙血树叶用超纯水把叶片清洗干净，每4片长花龙血树叶用锡箔纸包裹住放入保鲜袋中，于-80℃的冰箱中保存备用。

（2）蛋白提取：利用 BPP+酚提取法提取长花龙血树叶的蛋白。称量 3 g样品于用液氮预冷的研钵中，加入0.3 g的PVPP和0.3 g二氧化硅粉末研磨；转移到 10 mL离心管中，加入10 mLBPP提取缓冲液充分涡旋震荡10 min；再加入10 mLTris饱和酚，涡旋10 min；在SIGMA3-18 K低温超速离心机中离心15 min（4℃，转速：16 000 g）；移取上层清液转移至干净离心管中，加入5 mL BPP提取缓冲液，涡旋震荡10 min后离心15 min；再移取3 mL上清液转移至干净离心管中，加入15 mL预冷的AM沉淀剂，置于-20℃冰箱中沉淀12 h以上，从冰箱中取出离心管，离心15 min弃去上清液；重复2次转移及离心步骤；风干样品（约 3 h）再加入蛋白裂解液，放置于22℃恒温裂解 2 h以上；离心后转移上清液于10 mL离心管中，放置在-20℃冰箱中保存；采用Bradford法测定样品的蛋白浓度[6]，根据文献[6]进行单向电泳实验，确定双向电泳的最佳上样浓度。

（3）双向电泳实验：移取285 μL蛋白溶液、160 μL蛋白裂解液和5 μL IPG Buffer于离心管中，在IPG胶条（pH 4～7）上水化上样；保持室温 20℃左右，设置聚焦极限电流为每根胶条50 μA，电压分别为 250、500、1 000、1 000～8 000、8 000、1 000 V，时间分别为3、2、1、3、12 h、任意时间，进行一向等电聚焦；再将胶条放置在摇床上平衡15 min；在制备好的聚丙烯酰胺凝胶上进行二向垂直电泳操作，设置参数：5 W/每张胶片进行预电泳1 h，7 W/每张胶片至电泳结束；再进行凝胶染色和脱色、凝胶扫描和用 Image Master软件分析凝胶图谱，筛选出其中高表达的蛋白并进行编号[6]。

1.2.2 蛋白的生物质谱鉴定 挖取高表达蛋白质；分别用150 μL超纯水、150 μL脱色液、和100 μL乙腈处理，放置在摇床上摇荡30 min，转速设置为150 r/min，摇荡后吸出离心管中的水，以上步骤重复3次，直至蛋白粒变为无色，置于室温下风干；将蛋白样品离心后加入适量胰蛋白酶，放置在4℃冰箱中1 h左右；再将其放置在PCR仪上酶解蛋白（37℃，13 h）；设置转速7 000 g，离心5 min（20℃），备用；利用MALDI-TOF-MS进行蛋白鉴定；再通过蛋白质数据库搜索，确定蛋白的名称、种类及其他信息[6]。

2 结果与分析

2.1 长花龙血树叶蛋白的单向电泳和双向电泳分析

通过Bradford法来测定长花龙血树叶的蛋白浓度，在波长为595 nm处通过测定系列梯度浓度的标准牛血清蛋白溶液的吸光度值，建立标准曲线方程（图略），计算得出长花龙血树叶蛋白溶液的浓度为4.568 mg/mL。

为获得双向电泳合适的上样浓度，进行单向电泳实验，结果如图1。从图1可看出，长花龙血树叶的蛋白分子量15～130 kDa，主要在55 kDa左右。

图1 长花龙血树叶单向电泳凝胶图

通过双向电泳实验可以得到清晰明显、分离效果很好的蛋白凝胶图谱，再经 ImageMaster软件分析在蛋白凝胶图谱上标记 60个高表达的蛋白点（图2）。

图2 海南长花龙血树叶双向电泳蛋白凝胶图谱

2.2 长花龙血树叶主要蛋白的质谱鉴定

将 60个高表达蛋白点经过挖点和酶解处理后，利用生物质谱技术对其进行分析和鉴定，再通过植物蛋白质数据库进行对比来确定这些蛋白的种类、名称及其它信息，鉴定结果如表1所示。

表1 蛋白质谱鉴定结果

续表1 蛋白质谱鉴定结果

以上通过 Bradford法、双向电泳实验和MALDI-TOF-MS质谱技术对海南产长花龙血树叶植物蛋白进行提取、分离及鉴定实验，鉴定出了45个蛋白，从属多种蛋白类型，对相关的功能进行了初步分析。

编号 1蛋白为蛋氨酸合酶（methionine synthase，MS）或甲硫氨酸合酶，即N5-甲基四氢叶酸（MTHF）-同型半胱氨酸（Hcy）甲基转移酶，它是叶酸代谢的关键酶，其位于叶酸代谢的上游，负责将MTHF转化为四氢叶酸（THF），而THF是参与叶酸循环的重要活性形式，其不足会导致嘌呤和嘧啶的合成受阻，进而抑制DNA的合成，从而抑制细胞的分裂和生长[7]；另外一个功能为：通过几个相互作用和介于甲基钴胺素辅因子及其底物电子转移的S-腺苷甲硫氨酸循环，蛋氨酸合酶可从半胱氨酸再生出甲硫氨酸[8]。

编号2、11、13及53蛋白为ATP合酶亚基β（叶绿体），ATP 合酶广泛分布于线粒体内膜，位于线粒体内膜、叶绿体类囊体膜和光合菌质膜上，参与呼吸链氧化磷酸化的最后环节，参与氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨膜质子动力势的推动下合成ATP。ATP合酶功能与生物体能量代谢密切相关。亚基β的功能表现在ATP水解时，β亚基是推动γε中心柄旋转的动力来源；β亚基对ATP合酶空间构象有影响；β亚基对底物ATP具有高选择性，可有效提高催化效率[9]。

编号3及7蛋白为细胞分裂蛋白WhiA，细胞分裂是所有生物生命活动中最为重要的事件之一，真核生物通过依赖细胞分裂蛋白的蛋白激酶与相应的细胞分裂蛋白形成复合体而促使细胞进入并完成细胞分裂过程；同时，植物可通过转录和蛋白表达这2个过程，来调节细胞分裂蛋白在细胞内的水平[10]。

编号5蛋白为2-[(L-丙氨酸-3-基氨基甲酰)甲基]-2-羟基丁二酸脱羧酶，属于L-丙氨酸脱羧酶。自然界中常见的 20种 L-氨基酸不仅在生命体中组成各种各样的不同功能的蛋白质，还能够参与体内的代谢，为生命体的基本活动提供物质基础和能量。其中丙氨酸的代谢方式之一是在丙氨酸脱羧酶的催化下脱羧形成乙胺，而乙胺则参与植物体内糖类、多酚类和氨基酸等物质的代谢[11]。

编号8蛋白为转录抑制因子 NrdR，NrdR是来自天蓝色链霉菌作为I类和II类核苷酸还原酶的一种转录调控因子，由于这些酶为核苷酸的还原提供脱氧核苷酸，使其在 DNA合成过程中发挥重要的作用，而 NrdR作为一种抑制因子，通过在I类和II类操纵子的启动子区域结合来阻止基因的转录[12]。

编号9、10、12、17、54及56蛋白为核酮糖二磷酸羧化酶，核酮糖二磷酸羧化酶是高等植物叶片中含量极丰富的一种酶，其同时具有羧化与加氧双重功能，是光合作用与光呼吸作用的分水岭。其能够催化核酮糖-1,5-二磷酸和CO2的羧化反应和 O2的氧化反应，同时可以使核酮糖-1,5-二磷酸参与光呼吸途径，是影响植物光合作用的关键性酶[13-14]。

编号19蛋白为景天庚酮糖-1,7-二磷酸（叶绿体），叶绿体能通过吸收光能并将其转化为生物能而为自身的生长发育提供所需的营养物质，叶绿素作为植物体中叶绿体的重要组成部分，是植物进行光合作用的主要色素和作物生长诊断的重要参数[15]。

编号20及57蛋白为氧化酶活化酶/核酮糖二磷酸羧化酶（RuBisCO activase, RCA），是一种由核基因编码的可溶性叶绿体蛋白，普遍存在于高等植物、绿藻和蓝细菌中，其在植物中具有抗逆性作用，如减轻高温对RuBisCO的钝化或活性的恢复，从而维持植物在高温下一定的光合速率中发挥关键作用；对低温胁迫表现在可维持光合碳同化速率以完成抵抗胁迫响应及盐和渗透等其它胁迫条件下的响应[16]。

编号 21蛋白为铁氧还蛋白-NADP还原酶，它是生物体内非常重要的酶之一，其同工酶参与了光合电子传递、CO2的固定、N的同化、抗氧化胁迫等生化、生理过程。在植物体内，过表达铁氧还蛋白-NADP还原酶可能有利于C、N的固定，从而可以提高转基因植物的产量[17]。

编号22蛋白为细胞色素C氧化酶亚基，线粒体是哺乳动物细胞质中唯一含有遗传物质的细胞器，其基本功能是通过氧化磷酸化，以ATP的形式为细胞提供能量，被称为细胞的“动力工厂”。线粒体细胞色素 C氧化酶（mt-COX）是线粒体内呼吸链复合物Ⅳ，定位于线粒体内膜，哺乳动物mt-COX由13个亚基组成，由亚基组装成有功能的全酶是一个复杂的过程，需要多种分子伴侣和装配因子的协助才能完成[18]。

编号23、24、25、26及52蛋白为产氧增强蛋白，它不仅是涉及释放氧和光合系统稳定性的一种重要蛋白，而且在植物响应外界环境盐胁迫和高 pH条件下维持光合系统稳定性中发挥重要作用[19]。

编号 27蛋白为赖氨酸特异性脱甲基酶（LSD），是一种黄素依赖型单胺氧化酶编码的基因，其可以使单双甲基化赖氨酸去甲基化，特别是组蛋白3、赖氨酸 4 和赖氨酸9，是第一批被发现的蛋白质赖氨酸脱甲基酶。功能分析表明LSD 定位于细胞核内，调控着基因转录的激活和抑制，被誉为细胞深处的基因“开关”，在胚胎发育发生过程中起着重要的作用[20]。

编号28和60蛋白为氨基酸-tRNA连接酶，核酸连接酶在原核生物及真核生物中普遍存在，其功能是通过在3'OH和5'PO4基团之间形成磷酸二酯键来维持核酸骨架分子的正确和稳定性。tRNA连接酶是一种多功能酶，可将相应的tRNA半分子链接成整分子tRNA植物的tRNA连接酶，在未折叠蛋白反应中有重要作用，可加固特定转录因子和细胞质拼接等[21]。编号 28蛋白为异亮氨酸-tRNA连接酶，植物叶绿体的tRNA可被异亮氨酸氨酰化，参与对胞啶的修饰[22]。编号 60蛋白为苏氨酸-tRNA连接酶，其能够促进蛋白质的结合与沉积，使氨基酸平衡，减少由于生长抑制而引起色氨酸和蛋氨酸过量的问题，促进各类蛋白质的生长和发育[23]。

编号29蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，在植物细胞内部是组成性表达的蛋白，参与细胞的糖酵解过程[24]；作为一个多功能蛋白，也参与多种亚细胞的水平活动，在催化微管聚合、参与膜转运及膜融合、促进细胞程序性死亡和调节蛋白质的表达等方面发挥多种作用[25]。

编号33及55蛋白为过氧化氢酶，是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,作为生物体内重要物质, 其最为主要的功能就是参与活性氧代谢过程，是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一。在环境胁迫等逆境情况下, 可导致生物体内自由基增多, 使细胞膜产生过氧化, 导致细胞膜的破坏和损伤。过氧化氢酶与超氧化物歧化酶、过氧化物酶共同组成生物体内活性氧防御系统, 在清除超氧自由基、H2O2和过氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥重要作用[26]。

编号31蛋白为天冬氨酸1-脱羧酶，脱羧酶是能催化羧酸分子中的羧基脱去并产生二氧化碳的酶类，包括氨基酸类脱羧酶和有机酸类脱羧酶。天冬氨酸1-脱羧酶能催化脱去L-天冬氨酸的α羧基生成β-丙氨酸，而β-丙氨酸是合成泛酸的前体，泛酸是B族维生素的一种，可构成辅酶A的一部分，在各种组织内的内源代谢能量交换方面发挥重要作用[27-28]。

编号32蛋白为癌胚抗原相关细胞粘附分子，细胞表面的分子统称为细胞粘附分子，由于细胞与细胞、细胞和细胞外基质的相互粘附是构建机体的组织器官及维持其功能的最基本生命现象，这种相互粘附作用是细胞粘附分子参与介导的，故在介导单核细胞内皮细胞粘附方面起重要作用[29]。癌胚抗原是最具有代表性的肿瘤标志物，在多种恶性肿瘤组织中高表达，对癌症的临床诊断具有较好的敏感性和特异性[30]。

编号35蛋白为粘附 G蛋白偶联受体，在认知障碍相关疾病中扮演着重要角色，是一个超级膜蛋白家族，不仅可以识别并整合细胞外环境中各类信号分子，还激活细胞内异源三聚体中的G-protein，使得激活后的G蛋白联合三磷酸鸟苷（GTP）置换二磷酸鸟苷（GDP），引起异源三聚体会有解离等变化，将信号传送到细胞内的效应分子，进而引起细胞内的连续变化[31]。

编号39蛋白为甘露糖寡糖葡萄糖苷酶，属于糖蛋白，糖蛋白广泛存在于微生物和动植物中，是生物体内最重要的生物大分子之一，其参与的功能也是各有所异。植物中的糖蛋白参与众多的生命过程，如细胞壁的形成、受精、病原防御和细胞间通讯等。甘露糖寡糖葡萄糖苷酶的功能为在寡糖合成过程中，负责切除由脂质多萜醇转移到目的蛋白上的寡糖链最末段的葡萄糖残基，参与植物根系的发育[32]。

编号44蛋白为分选链接蛋白，作为一类保守蛋白家族，是指含有吞噬细胞氧化酶同源性结构域蛋白的统称。其功能为参与蛋白跨膜过程中货物分子接头蛋白与膜锚定蛋白的结合等蛋白间的相互作用, 在细胞内吞、蛋白分选、细胞信号转导、膜运输、囊泡运输、膜重塑和细胞器运动等方面均起重要作用[33-34]。

编号46蛋白为热休克70 kDa蛋白，热休克蛋白是一类广泛存在于生物界且高度保守的蛋白质，生物体受热刺激、营养缺失、中毒、缺氧、渗透胁迫、创伤等其他应激源可诱导热休克蛋白表达，故也被称为应激蛋白。常作为分子伴侣在多种细胞的蛋白质折叠、重塑、运输和降解过程中发挥作用，进而参与机体应激损伤修复、细胞凋亡、免疫、肿瘤发生发展，乃至细胞的发育调控等多种生命活动[35-36]。

编号47蛋白为DNA错配修复蛋白，参与多种重要的生物学过程，若 DNA错配修复系统出现缺陷则可能使细胞出现微卫星不稳定，突变率显著提高，其完整表达对保证细胞遗传物质的稳定性具有重要意义；人类肿瘤部位、分化程度和分期与 DNA错配修复蛋白表达密切相关，其表达缺失患者愈后明显较差，可作为判断患者愈后的一个潜在标志物[37]。

编号 48蛋白为 Pre-mRNA 剪接因子，Pre-mRNA在剪接体发生剪接，剪接体的组装和活性对剪接位点的选择和催化作用非常重要。Pre-mRNA 剪接因子在植物响应非生物胁迫方面发挥重要作用，且不同的剪接因子在植物协迫反应中扮演不同的角色[38]。

编号 50蛋白为光系统Ⅱ稳定性/组装因子，植物叶绿体中的氧化还原调控，在生长发育、基因表达调控、细胞信号转导和抗逆等生命活动中起非常重要的作用。光系统Ⅰ与光系统Ⅱ涉及高等植物2个光系统复合物组装和功能调控，结构上由核基因与叶绿体基因共同编码的蛋白组成的多亚基色素蛋白复合体，其复合物组装过程中蛋白以一定地次序合成并组装，且每一个过程都需要一个或多个调节因子的参与[39]。除了结构蛋白亚基，光系统Ⅱ还包含了用来结合反应中心蛋白的色素和辅因子，伴随强烈的氧化光化学反应，使得这些反应中心蛋白易受到光损伤并加速它们的周转[40]。

编号58蛋白为铁红杆菌素受体，铁是多细胞生物和几乎所有微生物的必需微量元素，铁蛋白是细胞内储存铁的蛋白复合体，可将铁以稳定的Fe3+储存起来，防止细胞内产生过多的游离Fe2+，并在细胞内可利用铁降低时释放储存的铁来维持细胞内铁稳态。铁蛋白和转铁蛋白能够降低细胞内铁水平，位于细胞膜上的转铁蛋白受体（transferrin receptor，TFRC）能够与携带游离铁的转铁蛋白结合，将细胞外铁转运到细胞内，提高细胞内铁水平，对细胞铁稳态起到重要作用[41]。大多数细菌在缺铁环境中会生产和分泌一种被称为铁载体的小分子铁结合化合物，并通过同类运输蛋白内在化这些铁复合物，而铁红杆菌素受体涉及细菌在响应铁饥饿时，在操纵子发生聚合，从而进行其生物合成的4个主要步骤[42]。

编号59蛋白为tRNA-鸟嘌呤转糖基酶，也被称为 tRNA鸟嘌呤核糖转移酶，是一种用喹啉催化取代鸟嘌呤的酶，可以使 tRNA中的部分鸟嘌呤核苷合成苷。糖基转移酶的种类较多，具有较高的特异性，参与细胞间信号转导、黏附等生理过程，其表达或功能的失调失控均参与多种病理过程[43-44]。

以上结果分析中，编号 4蛋白高密度脂蛋白结合蛋白的得分和覆盖率低，编号41蛋白为推定的未表征蛋白质 ENSP00000382790同源物及编号51蛋白为蛋白质 sepa-1无合适文献支持，因此没有对这3个蛋白进行功能分析。从其他的蛋白功能分析结果可看出, 提取的长花龙血树叶中的主要蛋白涉及生长、发育及植物抗逆等多种功能，有些不仅也与动物体内所含蛋白名称一致，而且大多数蛋白以及酶都具有一定的药理活性，比如蛋氨酸合酶对防治肝脏疾病和砷中毒能到达一定的有效性治疗[7]，热休克70 kDa蛋白对攻击感染产生有效的免疫保护性[45]，tRNA-鸟嘌呤（15）转糖基酶可在肺腺癌中有特异性，无论是对肝脏疾病或者提高免疫力、促进机体健康等方面都能有一定的作用[44]。

3 结论

本实验选择海南地道产长花龙血树叶作为研究对象，建立了提取分离长花龙血树叶的蛋白指纹图谱的方法，并鉴定分析了其中所含主要蛋白及其功能，确定了与长花龙血树药物活性相关的蛋白名称，对补充说明有关长花龙血树药理作用的物质基础、进一步对长花龙血树叶的育种和开发以及为海南黎药的开发应用提供科学合理的理论依据，对理解海南岛的生态系统服务和生态效益也具有一定的理论和实践意义。