幽门螺杆菌分子耐药检测指导的个体化治疗研究进展

林垲皓 黄丽芳 李爱民

幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）是一种可传播的革兰阴性病原体，在我国和全球的感染率约为50%[1-2]。根除Hp 感染是降低消化道溃疡、防范胃癌的有效策略[3-4]。传统的经验治疗是根据当地抗生素的耐药特征开出处方，其方案可包括三联疗法、非铋剂四联疗法（如序贯疗法、伴同疗法和混合疗法）和铋剂四联疗法，疗程可为7～14 d[5]。然而，随着Hp 耐药率日益升高，经验治疗根除率一直下降，《第五次全国Hp 感染处理共识报告》推荐的14 d 铋剂四联疗法的Hp 根除率仅为76.7%[6-8]。在此形势下，分子生物学耐药检测技术因可以比传统的基于培养的药敏试验更加快速、简便地获得Hp 的耐药信息，并且其指导的个体化治疗可以提高Hp 的根除率和避免不必要的耐药抗生素的使用，因而越来越被认可和重视[9]。然而，基于分子生物学耐药检测的个体化治疗的具体指导形式、用药方案及治疗效果尚不清晰。因此，本文就基于分子生物学耐药检测指导的个体化治疗的诊治研究进行系统综述和分析，为个体化治疗的临床应用提供参考。

1 Hp耐药机制

最近一项研究显示，我国Hp 对克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、阿莫西林、呋喃唑酮、四环素的原发性耐药率分别为37.0%、34.2%、87.9%、2.2%、1.6%、1.2%，继发性耐药率分别为76.9%、61.6%、93.5%、6.1%、3.1%、3.3%[10]。Hp 对克拉霉素耐药主要是因为23S rRNA 基因的点突变导致克拉霉素与核糖体结合力降低，这些突变包括A2143G、A2142G、A2142C 等，其中A2143G 和A2142G 位点的突变占80%以上[11-13]。实际上，目前大多的商用分子耐药检测试剂盒仅涵盖23S rRNA 基因的A2142G和A2143G 两种突变位点。喹诺酮类药物的抗菌机制主要是抑制Hp 复制过程中所必需的DNA 回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，从而抑制细菌增殖[14]。Hp 对左氧氟沙星的耐药主要是由于编码DNA 的gyrA 基因喹诺酮耐药决定区中两个密码子（Asn-87 和Asp-91）发生突变所致[15]。而阿莫西林、四环素、呋喃唑酮、甲硝唑、利福平耐药分别主要由于PBP-1A、16S rRNA、oorD 和porD、rdxA 和frxA、rpoB 的 突变所致[11-13]。

2 Hp耐药的分子生物学检测技术

传统的耐药检测是基于培养并通过琼脂稀释法、纸片扩散法或E-test 来检测Hp 表型耐药，具有实验室设备要求高、技术操作难度大、耗时（需7～10 d）、可重复性较差、存在一定主观性等缺点和局限，难以临床推广[14]。而分子生物学耐药检测技术大多数以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础，其可以在新鲜的、冷冻的或石蜡包埋的胃黏膜组织甚至是粪便和胃液上进行检测，最快可在数小时内获得耐药检测结果[9，16]。

目前已经发展了多种分子检测技术，各种检测方法都有相应的优缺点。这些检测方法有PCR 测序、PCR 限制性片段长度多态性分析、荧光共振能量转移RT-PCR、肽核酸探针RT-PCR、双启动寡核苷酸引物PCR、微滴式数字PCR、基因芯片、全基因组测序、原位杂交、蛋白质的分子检测等[14，17]。RT-PCR 方法具有准确可靠、敏感度高、操作简便、快速经济的优点，是临床耐药检测的主流[16]。由于克拉霉素和左氧氟沙星耐药基因的突变主要为单核苷酸突变，因而非常适合PCR 技术检测。研究也表明克拉霉素和左氧氟沙星的基因型耐药与表型耐药具有较好的一致性[18-19]。然而，PCR 耐药检测也存在一些明显的不足与缺点。一方面，临床应用的分子生物学耐药检测大多仅检测克拉霉素的耐药突变，少有同时检测左氧氟沙星和/或其他抗生素的耐药突变，因而分子耐药检测覆盖的抗生素类型较为局限。另一方面，耐药检测的标本多为通过胃镜操作有创取样的胃黏膜组织，而对于粪便、胃液等这种无创取样的标本仍较少应用，因为PCR 检测方法的准确性可能会受到样本条件及DNA 污染或降解的影响[14]。例如，死亡细菌的DNA 可能会导致假阳性结果。此外，粪便样本含有Hp DNA 量少并且粪便中血红蛋白及其降解产物、多糖复合体、重金属和蛋白质等物质可能会降解DNA 而影响结果的准确性[20]。最后，PCR 方法只能准确地针对有限数量的核苷酸，不能检测与耐药相关的所有可能突变和复杂结构变体。目前商业上可用的分子耐药检测只能检测最常见的耐药突变类型，额外的耐药突变或替代机制容易导致假阴性结果[14]。对于其他分子检测技术，如全基因组测序可检测Hp 的全基因组，获得更为全面的细菌基因型分型，具有能够检测到新的、罕见的和复杂耐药机制的能力和优点[14，21]，然而其成本昂贵、检测周期较长难以临床普及。基因芯片技术则具有准确可靠和高通量的特点[17]，但临床样本少时检测成本昂贵。

3 基于分子生物学耐药检测的个体化治疗

分子生物学耐药检测指导的个体化治疗是指根据相关耐药基因突变检测的结果选择敏感抗生素治疗，若无敏感抗生素可供选择，则根据当地人群耐药特征选择耐药率低的抗生素或结合既往用药史选用其他合适的抗生素治疗。

3.1 仅检测克拉霉素耐药突变的个体化治疗 克拉霉素耐药率的增高使含克拉霉素的三联疗法[22-23]和铋剂四联疗法[24-25]的初治根除率均降至难以接受的70%左右。另外，标准三联疗法对单一克拉霉素耐药菌株的根除率更是低至40.7%[26]。随着国内外对首诊根除成功的重视，克拉霉素耐药的分子检测指导的个体化治疗被推荐列入一线治疗（即首次治疗）[5，27-28]。实际上，目前发表的相关研究大多仅检测克拉霉素的耐药突变以指导一线治疗。这些研究表明，在初治患者中仅检测克拉霉素基因型耐药指导的个体化治疗的意向治疗分析（intentionto-treat，ITT）根除率为77%～96%，符合方案分析（per-protocol，PP）根除率在86%以上[24，29-30]。在这些个体化治疗中，对23S rRNA 突变阴性的敏感菌株选用含克拉霉素的方案能使PP 根除率达87%以上：克拉霉素联合阿莫西林的三联疗法的根除率为88%～97%，克拉霉素联合阿莫西林的铋剂四联疗法为87%～100%，序贯疗法则为94%（见表1）。在疗程方面，韩国的一项回顾性研究表明，7 d 与14 d 的 克拉霉素三联疗法对23S rRNA基因突变阴性Hp的根除率无差异（ITT：88.4% vs 85.9%，P=0.453）[31]。而对于23S rRNA 突变阳性的耐药菌株的治疗，我国的研究显示阿莫西林联合四环素的铋剂四联疗法的PP 根除率为86%[24]，阿莫西林联合呋喃唑酮的铋剂四联疗法的PP 根除率为94%[32]；而韩国的多项研究显示使用甲硝唑联合四环素的铋剂四联疗法对耐药菌株PP 根除率达到91%以上（见表1）。上述这些结果说明仅检测克拉霉素耐药性指导的个体化治疗对首次治疗患者具有较好的效果。然而，对于复治患者，由于克拉霉素的继发性耐药率会高度增高[10]，若个体化治疗的策略仅检测克拉霉素的耐药突变，则仅少部分患者可选用敏感的克拉霉素治疗，而剩余大部分克拉霉素耐药的患者则只能经验性用药。德国的一项回顾性研究显示，复治患者23S rRNA 的耐药突变率高达84.7%，这些耐药患者采用避开克拉霉素的三联或铋剂四联或大剂量二联疗法的总体根除率仅为66.7%[33]。因此，仅检测克拉霉素基因型耐药的个体化治疗适用于一线治疗患者，而对复治患者的临床指导价值有限。

3.2 同时检测克拉霉素和左氧氟沙星耐药突变的个体化治疗 同时检测克拉霉素和左氧氟沙星耐药突变指导的个体化治疗可能最具临床应用价值。在治疗Hp 的常用六种抗生素中，我国克拉霉素和左氧氟沙星中度耐药（原发性耐药率为20%～50%），甲硝唑高度耐药，而阿莫西林、呋喃唑酮和四环素轻度耐药并可忽略不计[7，10]，然而呋喃唑酮和四环素在我国难以普遍获得。因此，获得克拉霉素和左氧氟沙星的耐药信息对指导治疗尤为重要。相关研究表明，一线治疗采用阿莫西林联合敏感的克拉霉素或敏感的左氧氟沙星的三联疗法或铋剂四联疗法的Hp 根除率ITT 为84%以上，PP 为90%以上（见表1）。对于复治患者，希腊的一项小样本前瞻性研究中阿莫西林联合克拉霉素或左氧氟沙星的三联疗法对敏感菌株的根除率更是达100%[34]。对于难治性Hp 感染患者（既往治疗失败至少2 次），台湾的一项研究显示，对左氧氟沙星或克拉霉素耐药突变阴性的Hp 患者分别使用敏感的左氧氟沙星或敏感的克拉霉素联合阿莫西林和甲硝唑的序贯疗法（14 d）对敏感菌株的ITT 根除率为89%，然而对于左氧氟沙星和克拉霉素均耐药的Hp 患者采用四环素联合阿莫西林和甲硝唑的序贯疗法的ITT 根除率仅为70%[35]。这项研究表明，分子耐药检测可以有效分辨出对克拉霉素和左氧氟沙星敏感菌株因而保证了较好的复治根除率。实际该研究中个体化治疗的双耐药菌株患者由于阿莫西林和甲硝唑的较高耐药率，从而导致了根除成功率不佳。另外相关研究表明仅甲硝唑的单一耐药也即可降低序贯疗法疗效[36]。由于铋剂的应用可对Hp 耐药菌株的根除率额外增加30%～40%的根除率[37]，因而对于双耐药菌株采用铋剂四联疗法可能是更好的选择。总之，同时检测克拉霉素和左氧氟沙星耐药突变的个体化治疗对初治和难治性患者均存在指导价值，对突变阴性的患者可采用含敏感的克拉霉素或敏感左氧氟沙星治疗，而如果对克拉霉素和左氧氟沙星均耐药，选用不含克拉霉素和左氧氟沙星的铋剂四联疗法可能是较好的选择，其次为其他非铋剂四联疗法。

表1 仅检测克拉霉素或同时检测左氧氟沙星耐药突变的个体化治疗相关研究总结一览表

3.3 其他个体化治疗 有研究显示，Hp 对克拉霉素和左氧氟沙星的继发耐药率会显著升高（分别为76.9%和61.6%）[10]。因此，对于复治特别是难治性Hp 感染患者，仅检测克拉霉素和/或左氧氟沙星耐药突变对指导选用的敏感抗生素治疗的余地大幅缩小。因而同时检测克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四环素等多种抗生素的耐药突变可能是较好的选择。我国一项回顾性研究中，采用PCR 和测序的方法同时检测复治患者四种抗生素（克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林和四环素）的耐药突变指导的个体化治疗可达到令人满意的根除率[ITT：90.67%（136/150），PP：95.10%（136/143）]。我国的另一项小样本量的前瞻性队列研究中，对难治性Hp 感染患者分别使用PCR 和全基因组测序检测六种抗生素耐药突变，其指导的个体化治疗根除率分别为83.3%（10/12）和91.7%（11/12）。

另外，CYP2C19 基因多态性与质子泵抑制剂类药物代谢相关，其突变可影响胃液酸碱度，进而影响抗Hp 治疗效果。因此，检测CYP2C19 基因代谢型以选择相应的抑酸剂并结合常用抗生素耐药突变检测的个体化治疗也是较好的选择。日本的一项研究基于PCR 技术检测克拉霉素耐药突变结合CYP2C19 基因多态性指导的个体化治疗根除率达96%[46]。我国的杨莉丽等[17]基于可视化基因芯片技术同时检测克拉霉素、左氧氟沙星耐药和CYP2C19代谢类型指导的个体化铋剂四联疗法根除率达到91.2%。

3.4 个体化治疗与经验性治疗效果比较 分子药敏检测指导的个体化治疗是否优于经验治疗取决于各自治疗方案的制订。纵观目前相关研究报道，基于分子耐药检测的指导的个体化三联疗法优于经验三联疗法[22，38-39]，而当个体化治疗采用“敏感菌株用三联疗法而耐药菌株用铋剂四联疗法”策略时，其疗效与经验性伴同疗法和铋剂四联疗法相当[42-44]。需注意的是，目前大多数发表的个体化治疗研究以检测克拉霉素的耐药突变为主，所获得的耐药信息有限，可供选择的敏感抗生素非常有限。另外，大多数研究的克拉霉素分子耐药检测仅涵盖23S rRNA基因的A2142G 和A2143G 这两种突变[22，30，44]，因而存在克拉霉素耐药假阴性的风险，从而降低了个体化治疗的根除率。然而，由于铋剂可以提高对耐药菌株的根除率，因而在个体化治疗中使用铋剂可以一定程度上补救假阴性结果导致的不良影响。研究表明，当个体化治疗中对基因型敏感和耐药的菌株均采用铋剂四联疗法时，其Hp 根除率疗效优于经验性铋剂四联疗法[24-25]。

在药物依从性方面，个体化治疗和经验治疗间依从性相似[24]，尽管当个体化治疗中的敏感菌株感染患者使用不含铋剂的三联疗法也同样如此[42，47]。在药物副作用方面，只有当个体化治疗采用更少的药物治疗（即不使用铋剂）时才可能显示出优势[30，43-44]。韩国的两项研究显示，个体化治疗组中采用“敏感菌株用三联疗法而耐药菌株用铋剂四联疗法”方案时，其副反应发生率显著低于经验组的含铋四联疗法和伴同疗法[30，44]。

4 小结和展望

总而言之，分子耐药检测技术可以较为准确可靠地检测Hp 的耐药性，并且其指导的个体化治疗具有较好的效果。然而，目前的分子耐药检测技术存在着耐药检测范围有限、大多需胃镜操作的有创取样及存在假阴性风险等不足和局限。因此，耐药检测覆盖范围广、取样简单、快速简便、经济准确的分子耐药检测技术仍待研发和突破。