肾穿刺石蜡切片厚度对肾小球系膜区及基膜PASM染色的影响

梁婷玉，冼志红

肾穿刺活检组织病理诊断中，过碘酸六胺银染色(periodic acid-silver metheramine， PASM)是重要的检查方法，主要用于显示肾小球系膜区范围和基膜增厚以及“钉突”、“梯状”等病理变化，是肾小球疾病鉴别的重要手段之一[1]。PASM染色质量对诊断有一定程度的影响。切片过厚肾小球结构重叠，难以分辨，半薄切片制片时不仅切片难度增加，且切片过薄高温孵育容易掉片。本实验经过多年研究找到一种最佳PASM染色的切片厚度，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2021年1～10月上海中医药大学附属曙光医院病理科肾穿刺活检标本30例，其中IgA肾病10例，新月体性肾小球肾炎3例，狼疮性肾炎、增生硬化性肾小球肾炎和局灶节段性肾小球硬化症各4例，肾小球微小病变5例。

1.2 试剂及仪器PASM染色液(六胺银染色法)购自珠海贝索公司。试剂盒内含以下试剂：(1)1%过碘酸；(2)50 mL硼砂溶液、5 g六次甲基四胺银粉剂；(3)0.25%硫代硫酸钠水溶液；(4)伊红染液。标本均采用10%中性福尔马林固定4～6 h，经Leica ASP300全自动脱水机进行常规脱水、使用Leica EG1150H石蜡包埋机进行包埋，Leica RM2235石蜡切片机进行常规切片，切片厚度分别为1、2和3 μm。

1.3 方法(1)石蜡切片常规脱蜡入水。(2)1%过碘酸氧化5 min，蒸馏水冲洗。(3)50 mL硼砂溶液+5 g六次甲基四胺银粉剂充分震荡混匀，置于62 ℃孵箱预热15 min，经氧化后的切片浸入60～62 ℃预热的六胺银工作液中30～40 min，工作液开始呈浅棕色，每隔5～10 min镜下观察，至肾小球毛细血管基膜呈黑色，蒸馏水洗2 min ×3次。(4)浸入0.25%硫代硫酸钠水溶液1～2 min，自来水洗2 min×3次。(5)HE染色10 s，自来水洗。(6)常规脱水透明，中性树胶封固。

1.4 结果判读PASM质量根据肾小球系膜区及基膜区域染色进行评分，肾小球囊基膜和肾毛细血管基膜呈黑色，显色清晰，细胞基本无重叠，细胞质呈红色，对比强烈为3分。肾小球囊基膜和肾毛细血管基膜显色过深或过浅，细胞部分重叠，细胞质红色对比不明显为2分。肾小球囊基膜和肾毛细血管基膜显色过深或过浅，无法辨别，细胞重叠，细胞质红色无对比为1分。

1.5 统计学分析采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，采用χ2检验，检验水平α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PASM染色质量本组PASM染色比较：基膜呈黑色，无重叠，胞质为红色，对比明显，切片厚度2 μm组评分(2.65±0.356)略高于1 μm组(2.35±0.425)，差异无统计学意义。切片厚度1、2 μm组明显优于3 μm组(1.58±0.312，P<0.05)。

2.2 PASM染色三种厚度切片形态学比较本组通过三种厚度切片染色比较发现，切片厚度3 μm组基膜结构较厚，银染后显得粗且黑，细胞结构重叠现象较严重，导致一部分“钉突”等结构难以辨认，复染颜色也难以显现(图1)。切片厚度2 μm组细胞有部分重叠，银染后基膜呈清晰黑色并有一定的立体感，复染后着色鲜明，肾小球与周围组织对比清晰(图2)。切片厚度1 μm组细胞重叠较少，基膜显色清晰，但是复染对比不清晰(图3)，且30例切片中有5例掉片。

①A①B②A②B③A③B

3 讨论

PASM法是通过过碘酸氧化组织，使肾组织基膜内的黏多糖暴露出醛基，醛基将六胺银还原为黑色的金属银，氯化金可调整显色度，硫代硫酸钠对已显色的银盐起固定作用，并除去未反应的银离子，伊红复染细胞质。PASM染色可清楚地显示肾小球基膜及肾小球膜无细胞物质。对肾小球膜的染色优于PAS反应；对基膜的染色则不如PAS反应[2]。因此，肾穿刺活检病理学诊断中常同时使用以互补。

肾穿刺活检中，不同的特殊染色应选择不同厚度的石蜡切片[3-6]。豆文宪等[4]和喻宏等[5]认为肾穿刺活检石蜡切片1～1.5 μm厚对PAS染色和PASM染色效果最好，细胞呈单层分布，肾小球系膜显示纤细、清晰，无背景着色。李敏等[6]认为肾穿刺活检石蜡切片染色淀粉样物质(刚果红染色)时，厚切片(≥5 μm)与薄切片(≤3 μm)相比，其阳性部位着色明显，颜色鲜艳，结果稳定，可有效减少或避免薄切片的假阴性现象。本实验采用1 μm厚切片染色后，细胞单层分布，清晰判别肾小球基膜和系膜，但复染对比不够强烈且偶有掉片现象。2 μm厚切片肾小球基膜和系膜清晰可见，略有重叠增加了切片立体感，复染后肾小球与周围组织对比明显，且30例2 μm组切片均未掉片。3 μm厚切片细胞结构重叠明显，一部分结构难以辨认，复染颜色也难以显现。本组认为切片2 μm厚是最佳PASM染色的厚度。

在常规检查过程中≤3 μm的切片即为半薄切片，制作半薄切片对于蜡块硬度要求较高，在实际操作中可以把蜡块及崭新锋利刀片置于冰箱-18 ℃冷冻约0.5 h，使其充分冷却再行切片，制作的切片过程比较顺利，切片质量也较高。另外，PASM染色法中，硼砂-六胺银工作液必须充分混匀，现配现用，未使用的试剂日常保存应注意避光4 ℃低温存放，按试剂说明书要求，工作液应提前62 ℃水浴锅预热15 min后将氧化后切片放入工作液，30 min后观察工作液颜色变化，每5 min镜下观察显色程度以避免过染现象。《临床技术操作规范·病理学分册》[7]推荐PASM染色孵育温度为60 ℃，为提高工作效率及降低背景着色，本试剂调整了硼砂-六胺银工作液浓度，经过反复试验得出的最佳反应温度为62 ℃，不仅缩短了反应时间，着色效果也更佳。

在实际操作中，本研究使用自配六胺银染液对1 μm厚度切片进行染色，其掉片率较高，可能与氧化试剂浓度过高有关：自配过碘酸试剂浓度为2%，而商品化试剂盒中过碘酸浓度为1%。另外，切片经62 ℃孵育时间过久也会引起掉片，60 ℃或62 ℃孵育30 min内对掉片率无明显影响，为避免掉片现象，于工作液中作用30 min后的切片应密切关注染色情况。

肾穿刺活检病理切片是一种既传统又经典的制片技术，要制作一张优质的PASM染色切片影响因素较多，如切片厚度、染色时间、温度、试剂浓度等。随着诊断要求的提高，病理技师在制作切片的时候应多思考，详细了解每种特殊染色的原理及其染色物质的要求，对于不同组织化学染色，把控多种干扰因素，采用不同厚度可以有效提高诊断效率，减少因切片厚度引起的假阴性或假阳性。