大鼠脂肪干细胞在纳米羟基磷灰石-壳聚糖-果胶/壳聚糖-明胶支架的成骨向分化研究

韩瑞金，张 琪，郝 彤，李俊杰，王常勇

在口腔临床诊疗中， 常会遇到因颌面部创伤、颌骨囊肿切除或先天疾病所导致的颌骨缺损，如何有效地修复它是临床医生和科研人员面临的挑战之一。目前，自体骨块、同种异体骨移植物常常应用于临床。然而这两种方法都有一些缺点， 如可用取骨部位的限制、患者的意愿和附加术区术后的感染概率等，这都在一定程度上阻碍了自体骨移植的使用；此外，同种异体骨移植物因可能存在传播隐形疾病和免疫排斥等风险，在临床实际应用上并不乐观[1]。三维骨组织支架与种子细胞复合物的成骨分化研究为上述骨缺损的修复展现了一个新的治疗方向。

研究表明，骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）、人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，HUCMSC）、人牙龈间充质干细胞（human gingival mesenchymal stem cells，HGMSC）和胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC） 等都可作为组织工程成骨研究的种子细胞，但遗憾的是存在来源有限、数量稀少的不足。近年科研人员发现，取材于脂肪组织的间充质干细胞数量充沛，且在一定条件下可实现成骨向分化，弥补了上述几种干细胞的不足，因此其可作为该领域种子细胞研究的目标[2，3]。

要做到“两个过程”的合理性，即从数学知识发生发展过程的合理性、学生认知过程的合理性上加强思考，这是落实数学核心素养的关键点.前一个是数学的学科思想问题，后一个是学生的思维规律、认知特点问题.

在三维支架材料方面，仿天然颌骨无机物结构和成分的高聚物/羟基磷灰石复合材料因具有优秀的生物可降解性而受到了科研人员的青睐， 比如胶原蛋白/羟基磷灰石、海藻酸盐/羟基磷灰石等。 但这些三维材料多数依赖诱导剂促进干细胞分化，因此研发一种具有自发诱导种子细胞向成骨细胞分化的支架材料在骨组织工程领域至关重要。 天然来源的生物材料，如壳聚糖、透明质酸和明胶具有固有的生物相容性，表现出最小的不良免疫原性，被广泛应用于仿生支架的制造。它们既可以单独使用，也可以与其他生物聚合物结合使用，以促进骨的矿化再生[4]。 李俊杰等[5]运用冷冻干燥技术将纳米羟基磷灰石-壳聚糖-果胶（nano-hydroxyapatite-chitosan-pectin，nHCP） 复合物均匀分散于壳聚糖-明胶（chitosan-gelatin，CG）溶液中，制得多组分nHCP/CG 三维多孔支架材料，它具有良好的吸水性能、可调的降解特点和力学性能，且能够触发生化信号使MC 3T3-E1 细胞生长、 增殖。 目前，尚未见到基于nHCP 支架，以大鼠脂肪干细胞（rat adipose-derived stem cells，rADSC）为种子细胞，体外构建组织工程骨的研究报道。 笔者以rADSC 为种子细胞，nHCP/CG 为支架材料，同时以CG 支架作为对照组，体外观察细胞在上述支架材料黏附、增殖、定向成骨分化的趋势，为骨组织工程临床应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架材料中多呈球形，细胞间接触紧密，与材料贴附性好，HE 染色见胞浆呈红色，细胞核呈紫蓝色（图1）。 说明rADSC 在支架上生长较好。 Live/Dead 染色显示绝大多数细胞发绿色荧光，少见红色荧光（图2）。 这说明rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架材料中生长良好。

1.1.2 支架材料

nHCP/CG 和CG 支架由天津大学化工学院提供，直径10 mm、厚度1.5 mm 均匀圆片，真空干燥，60钴辐照灭菌。

1.1.3 主要试剂与仪器

α-MEM 培养液（Gibco，美国）；胎牛血清（MDgenics InC，美国）；地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸（Sigma，美国）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（碧云天生物技术研究所，中国）。

倒置相差显微镜及照相系统（OLympus，日本）；CO2孵箱 （Forma Scientific Inc， 美国）； 酶标仪（Bio Rad，美国）；流式细胞仪（Cytomics FC 500 Beckman Coulter，美国）。

1.2 方法

农村文化教育滞后的现实导致了留守儿童父母的家庭教育意识淡薄、教育观念陈旧。有些家长认为距离的遥远，心灵的缺失能由金钱物质来弥补，以获得内心的愧疚安慰。但是过分的物质补偿以及监护不到位下的金钱补助导致孩子畸形发展。甚至有些农村家长认为“读书无用论”，不知不觉弱化了孩子的学习意识。不仅如此，在外打工的父母认为将孩子送到了学校就是完成了任务，重分轻德，对孩子的关爱沟通极度缺失。

参照Zuk PA 等[2]文献中的方法，分离培养rADSC，待细胞融合至90%后传代培养。用流式细胞仪检测P4 代rADSC 细胞表面标志的表达情况，添加不同诱导剂进行定向成骨、成脂肪分化。 取P4 代rADSC用于后续实验。

1.2.2 大鼠脂肪干细胞在支架上的接种与培养

取P4 代rADSC，将含有9×106个细胞的细胞悬液60 μL 小心滴加到经60钴灭菌的nHCP/CG 和CG材料上，然后置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养5 h，5 h 后加入1 mL 培养液。采用HE 染色方法检测rADSC 在支架上的形态。

在逆城市化趋势下，从事简单劳动的进城务工人员被机械化所代替，面对高昂的居住成本和消费水平，从事简单劳动的务工人员将开始返乡之路。为了将这批返乡农民工妥善安置，政府不得不提前开始进行农村、乡镇及中小城市建设，完善市政基础设施和农业基础设施，改善劳作条件，大兴农田水利，提供更多工作机会，这也正是目前大规模进行新农村建设目的所在。而从事脑力劳动的白领阶层，面对大城市越发激烈的竞争和高昂的生活成本以及乡镇日益增加的工作机会，也会有相当一部分选择乡镇的静谧与安逸。

1.2.5 大鼠脂肪干细胞在支架上的增殖检测

1.2.3 大鼠脂肪干细胞在支架上的活性检测

细菌培养基：称量牛肉膏1.5 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 1.5 g、琼脂6.0 g，再加入清水300 mL煮沸，调节pH7.0。

rADSC 在支架上常规培养7 d 后弃去培养液，用Live/Dead 工作液在避光37 ℃条件下孵育30 min。 在荧光显微镜下观察细胞存活情况， 活细胞激发绿光，死细胞激发红光。

如图4 所示，rADSC 在nHCP/CG 支架 和CG 支架中于成骨诱导和非诱导条件下培养21 d 后， 茜素红染色均表现为橘黄色，证实有钙盐沉积；Von Kossa染色表现为棕黑色， 且nHCP/CG 支架的颜色较CG支架深，表明有矿化结节产生；Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性棕黄色。 说明rADSC 在支架中培养时有Ⅰ型胶原分泌。 结合ALP 活性结果说明，nHCP/CG支架能够促进rADSC 向成骨细胞分化。

常规培养1 h、2 h、4 h、6 h、8 h， 在不同时间点用PBS 冲洗去除未贴附的细胞；加入250 μL 0.5%结晶紫溶液，染色4 min；后加入500 μL 2%十二烷基磺酸钠，在100 r/min 的摇床放置10 min；吹匀后将每个样本的紫色溶液转移到96 孔板中，于570 nm 处测定各孔的光密度值。

“改革开放以来，全省民营经济发展经历了有限发展、鼓励发展、快速发展时期。”云南省工商联副主席夏云东说，党的十一届三中全会以后，个体工商业伴随商品经济的活跃恢复发展，禁区逐渐被打破，个体工商户的法律地位得到明确。

今后中级维修技师需掌握机械钳工、液压机电、电子通信等技术，高级维修技师需掌握一般诊断技术，技师需掌握高深诊断技术。今后国企与民企共存，4S店与综合汽修厂共存，大规模汽修厂与连锁保养店共存，由于技术资料公开、备件公开，综合汽修厂的实力将逐渐增强。汽车维修量的增长将由一线(北上广深)、二线(省城)，向三线(地级)、四线(所有)城市转移。汽车修理哪家强，就看诊断技术谁能担当，诊断技术能力强的维修企业客户资源必然多于诊断能力弱的维修企业。

常规培养1 d、3 d 和7 d 后， 用四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium salt，MTT） 法检测其增殖状态，于492 nm 处测定各孔的光密度值。

1.2.6 碱性磷酸酶活性检测

按照ALP 检测试剂盒步骤分别对在支架中培养14 d 和21 d 的成骨诱导组和非诱导组进行ALP活性检测。 成骨诱导培养液包含地塞米松终浓度0.1 μmol/L、β–磷酸甘油钠终浓度10 mmol/L、 抗坏血酸终浓度50 μmol/L。

1.2.7 大鼠脂肪干细胞在支架上的成骨分化及血管化检测

成骨诱导组和非诱导组培养21 d 后分别取材并制作石蜡标本，切片后行茜素红染色、Von Kossa 染色和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色，检测支架材料中细胞成骨分化情况；Ⅷ因子免疫组织化学染色检测支架材料中的血管生成情况。

1.3 统计学方法

rADSC 是贴壁生长细胞，细胞必须贴附于材料的表面才会有细胞的伸展、迁移、分化等行为。rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中的黏附数量随着时间的延长逐渐增加，并在6h 左右进入平台期（图3）。 说明细胞在支架上6 h 左右完成贴壁过程， 同时rADSC 在nHCP/CG 支架中的黏附能力高于CG 支架中的黏附能力。

㉓松村俊夫:《南京大屠杀大疑问》，赵博源等译，新华出版社2001年版，第111～116、130～132、135～139页。

2 结果

2.1 大鼠脂肪干细胞的形态、表型及多向分化能力

分离培养的rADSC 贴壁生长，呈长梭形，偶见不规则形状。流式细胞仪分析结果显示，4.1%的细胞表达CD31，0.3 %的细胞表达CD34，0.1 %的细胞表达CD45， 为阴性表达；99.9%的细胞表达CD29，99.0%的细胞表达CD90，为阳性表达。 说明rADSC 是间充质细胞。茜素红染色呈橘黄色，Von Kossa 染色呈棕黑色，Ⅰ型胶原免疫荧光显示细胞核呈蓝色且胞浆中有大量丝状胶原；油红“O”染色成鲜红色，说明rADSC是一种具有多向分化能力的干细胞。

2.2 支架中大鼠脂肪干细胞的形态与活性

选择SD 成年大鼠5 只，体质量60 ～80 g，雌雄不限。 实验所需动物（SD 大鼠）均采购自军事医学科学院实验动物中心， 动物生产许可证号SCXK （军）2012-0004。 使用经过学院动物伦理委员会审批。

1.2.1 细胞分离与鉴定

图1 rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中的HE 染色形态（100×）Fig.1 Morphologies of rADSC seeded in nHCP/CG and CG scaffolds by HE staining(100×)

图2 Live/Dead 染色检测rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中的活力（20×）Fig.2 Images of Live/Dead staining results of rADSC in nHCP/CG and CG scaffolds(20×)

2.3 大鼠脂肪干细胞在支架上的黏附与增殖

将MTT 法测定细胞增殖能力和ALP 活性检测的每个样本的光密度值输入SPSS 22.0 统计软件，建立数据库后进行t 检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义，P ＜0.01 为差异有显著统计学意义。

图3 rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中的黏附生长曲线Fig.3 Adhesion curves of rADSC in nHCP/CG and CG scaffolds

rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中培养1 d、3 d、7 d，细胞数量均逐渐增加（表1）；在nHCP/CG 支架中培养1 d、3 d、7 d 时细胞数量明显高于CG 支架中的细胞数量且差异有显著统计学意义（P<0.01）。 这说明nHCP/CG 支架较CG 支架更利于rADSC 的增殖。

排水管道的安装要点主要在于伸缩节的制作。在伸缩节制作之前，应全面考虑管道结构对伸缩节的影响，安装过程中除特殊要求以外，统一按照4m的间隔距离进行安装，可以保障排水管道的安全及高效运行。另一方面，排水系统所需的管道都需要先进行试验和检验，检验合格以后才能用于排水管道安装。此外，由于排水管道安装位置的特殊性，土方施工是施工中最主要的一部分，在开挖和支护沟槽时，应对施工区域的地基、地下缆线以及其他管道位置进行检查，以保证排水管道安装的顺利完成。

表1 rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中培养1 d、3 d、7 d细胞增殖比较Tab.1 Comparison of cell proliferation of rADSC cultured in nHCP/CG and CG scaffolds at 1-day,3-day and 7-day

2.4 大鼠脂肪干细胞在复合支架中的成骨分化能力

2.4.1 碱性磷酸酶活性

rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中培养14 d和21 d 时均表现出较高的ALP 活性（表2）。 第14 天时，在CG 支架诱导培养细胞的ALP 活性大于常规培养，差异有统计学意义（P<0.05），而在第21 天时差异无统计学意义（P>0.05）。 在nHCP/CG 支架中培养14 d 和21 d 的细胞加入诱导剂，ALP 活性小于常规培养且差异有统计意义（P<0.05）。 说明nHCP/CG 复合支架具有自发诱导rADSC 向成骨细胞分化的能力且效果优于CG 支架。

表2 rADSC 在CG 支架和nHCP/CG 支架中培养14 d 和21 d 时ALP 活性比较Tab.2 Comparison of ALP activity of rADSC cultured in CG and nHCP/CG scaffolds at 14-day and 21-day

2.4.2 成骨特异性免疫组织化学染色

1.2.4 大鼠脂肪干细胞在支架上的黏附检测

图4 rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中的成骨特异性免疫组织化学染色（100×）Fig.4 Images of osteogenic specific immunohistochemical staining of rADSC in nHCP/CG 和CG scaffolds(100×)

2.5 大鼠脂肪干细胞在支架上的血管化

在成骨诱导与非诱导环境下，rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架上培养21 d 后，Ⅷ因子免疫组织化学染色为阳性表达表现为棕黄色（图5）。 说明rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架上存在血管化趋势，可为缺损组织的修复提供适宜的微环境。

图5 rADSC 在nHCP/CG 支架和CG 支架中Ⅷ因子的表达（100×）Fig.5 Images of Ⅷfactor expression of rADSC in nHCP/CG and CG scaffolds(100×)

3 讨论

为克服应用同种异体骨或自体骨移植的缺点，基于干细胞的再生医学取得了发展，它促进了骨组织工程从传统的骨移植发展到精密医学时代（也称个体化医学），这是医疗保健的一个新领域[6]。 骨组织工程把医学、生物学和工程学结合起来，将分离的高浓度种子细胞经体外培养扩增后移植于天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解吸收的三维支架材料上，通过一种有效的生物机制以促进骨的形成和矿化[7，8]。

跟BMSC 相比，来源于脂肪组织的间充质干细胞可以简单地获得，其生物学性状稳定，可分化成多种细胞系，如血管内皮细胞、成骨细胞等，经常被用于体外和体内的骨再生[9，10]；研究还发现，ADSC 经诱导培养后，可表达CD31 和CD34，为干细胞的成骨提供了一个有利于血管化的微环境，更有利于仿生支架的成骨研究，满足未解决的医学需求[11~14]。

三维支架对干细胞的形态发生在方式上与天然器官类似，它可以诱导间充质干细胞分化，并促进磷酸钙晶型成核矿化[15]。 矿化异常会导致骨疏松或骨硬化，在成骨化过程中很关键，故研究人员也开始将干细胞的矿化能力作为硬组织组织工程的基本要素之一[16]；近年来，骨诱导型和无机仿生支架材料得到了优化，为干细胞的成骨向分化提供了一个更有利的微环境，可辅助和加速骨再生[17，18]。笔者采用的nHCP/CG支架具有合适的形状、稳定的理化结构、良好的吸水性能、适宜的降解速率及优良的力学性能，与CG 支架相比其压缩强度有所提高，与松质骨的压缩强度极为接近，可模仿天然骨组织的生物化学特性和结构[19]。

以对照组的常规护理结果，归纳总结患者发生突发事件的危险因素，以全面细致的分析总结，由于护理人员责任感以及技能不足，使得护理工作操作失误增加护理风险，加之骨科患者由于疾病长期躺在床上，不同程度的疼痛导致行动不便致使活动受限，出现压疮等现象[1] 。患者情绪不稳定使得依从性不足，加大护理工作执行难度，阻碍疾病恢复以及出现不安全行为。护理管理不到位是由于管理规章及执行力度不足，没有注重对骨科重伤病人的护理，使得科室护理风险隐患加重[2] 。

应用于临床骨组织工程的仿生支架材料应该具有重要的特性，如刚度、机械阻力和渗透性。笔者实验将rADSC 接种在nHCP/CG 支架和CG 支架材料上，发现nHCP/CG 支架不仅能够促进干细胞的黏附与增殖， 还可自发诱导种子细胞的成骨向分化。 这与nHCP/CG 中纳米羟基磷灰石的存在和支架材料的刚度密切相关[20，21]；此外，由于nHCP/CG 和CG 的自发诱导性，减少了与胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）的接触，从而增强了rADSC 成骨分化能力[22]。

随着经济发展，一些煤矿企业由于开采技术落后、资源枯竭和环境污染、长期亏损等原因，无法满足市场发展的需要，无奈退出市场。从20世纪90年代起，我国开始实施煤矿关闭破产政策，关闭大批资源枯竭、亏损严重、高硫高灰煤矿企业。煤矿企业关闭并不是一个简单的过程，随之而来的是诸如资产清理、职工安置、设备安排等一系列问题，其中职工安置最为重要。

在临床应用上，血管化的形成必不可少，这也是当下骨组织工程应用于实际临床的一大难关[23]，骨折和损伤通常需要很长时间才能自然愈合，血液供应不足，将面临骨坏死的窘境，从而间接导致骨再生失败。笔者实验Ⅷ因子免疫组织化学染色证明培养在nHCP/CG 支架和CG 支架上的rADSC 可以分泌血管形成因子，促进血管形成，可为骨缺损的修复改善血液供应微环境。 此外，创新的技术，如三维打印方法，目前正被用于宿主干细胞渗透、血管化、营养成分转移和干细胞细胞分化[17]。 Wan Z 等[24]研究人员将传统的三维生物打印技术中的时间概念整合为第四维度（four-dimensional，4D）， 促进了复杂的功能性生物结构的制作。

伴随研究的深入， 一些问题也需要解决。 虽ADSC 在体外可诱导成骨，但在诱导期间发现一些细胞出现凋亡且细胞增殖活性下降[25]。 Niemeyer P 等[22]发现是地塞米松、 抗坏血酸和β-甘油磷酸钠对细胞产生的生物化学刺激导致了细胞的频繁凋亡。所以如何减少或者取代成骨诱导剂是目前的关注点之一。Kuznetsov SA 等[26]认为含FBS 的培养液对BMSC 在体外的扩增有很大的促进作用， 但是对于临床应用，BMSC 与FBS 的接触应尽可能地减少，因为连续使用含FBS 的培养液培养BMSC， 其骨形成能力大大下降。 多年来人血小板裂解物 （human platelet lysate，hPL）被认为是无血清成分的干细胞培养的首选补充剂，Jafar H 等[27]研究结果表明，hPL 在单层培养和聚乳酸-乙醇酸[poly（lactic-co-glycolic） acid，PLGA]合成支架（三维）两种培养条件下都可诱导干细胞成骨，其功能与FBS 培养结果相似， 可作为根尖乳头干细胞（stem cells of apical papilla，SCAP）和牙周韧带干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC）生长、增殖分化的一种合适的动物源血清替代品。

在过去的几十年中，已经进行了许多尝试，通过促进多能干细胞（pluripotent stem cells，PSC）产生成骨细胞来修复和再生骨缺损[28，29]。 相关实验进一步证实了干细胞的终末分化是通过激活转录因子和遗传修饰的协同作用实现的，在间充质谱系中，runt 相关转录因子2 （runt-related transcription factor 2，RUNX2）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）等因子对于成骨和成脂是必不可少的[30]。通过对基因进行修饰，发现间充质干细胞能够打破原有的默认分化途径，可由成脂转化为成骨，反之亦然[31]。 此外，越来越多的研究表明，自噬和肌动蛋白在决定细胞形状、细胞核形状、细胞增殖和细胞强度方面发挥作用，并最终影响干细胞的分化[32，33]。确定rADSC 成骨分化的相关因素对于更好地理解其成骨分化机制具有重要意义[34]，下一步可探讨一下肌动蛋白在复合三维支架中对rADSC 成骨和成脂分化中的作用。

阀体内腔采用标准的角式流线型设计，且阀腔内过渡处尽量采用大圆弧设计，以避免滞留点和急转弯。若存在流速高、腐蚀性强的恶劣工况，阀体内壁还应采用喷涂硬质合金硬化处理，以提高阀体内壁耐冲刷和耐腐蚀能力。阀门公称直径及节流口规格应尽量按照设计数据表选型，以提高阀门的整体性能。

总体而言，nHCP/CG 支架具有良好的生物相容性， 能够支持rADSC 的黏附和生长， 更为重要的是nHCP/CG 支架在非成骨诱导条件下也可以促进rADSC 的成骨分化，这就大大降低了成骨诱导剂的使用量， 从而将减少其对细胞产生的生物化学刺激影响，进一步增强细胞的活性。 此外，nHCP/CG 支架中rADSC 在成骨分化的同时出现血管化趋势，这对骨缺损的修复具有十分重要的意义。因此具有类似天然骨组织微架构的nHCP/CG 支架在骨组织工程领域的进一步研究将带给人们更广泛的应用启示。