子宫切除术后阴道微生态的变化及其与外周血TLR2、TLR4表达和细胞免疫炎症因子的关系

袁永兴，高建建，逯蕾，胡茜，王靖

西安国际医学中心医院妇科一病区，陕西 西安 710100

阴道是由女性特殊解剖结构、阴道菌群、内分泌环境、局部免疫等组成的重要的微生态系统之一，其微生态稳态对维持阴道自净作用、维护女性生殖健康具有重要意义[1]。对于子宫切除术患者而言，手术本身可直接损坏阴道微生态解剖结构，而术前、术后抗生素使用可杀灭阴道正常微生物，加之术后腹水经阴道残端溢出、阴道积血或渗液排出不畅等原因，使得阴道酸性环境发生改变，这些均能导致阴道微生态严重破坏，继而增加患者阴道感染风险，引发多种妇科疾病[2-3]。Toll 样受体(TLR)是一类在机体固有免疫中扮演重要角色的模式识别受体，其信号通路异常表达对炎症反应发生进展具有重要意义，被认为与感染性疾病关联密切[4]。辅助性T 细胞(Th 细胞)在人体细胞免疫中起重要作用，可通过影响局部自然杀伤细胞活性、T淋巴细胞应答能力等影响女性生殖道清除病原体能力[5]。已有研究表明，阴道微生态变化与机体免疫功能可相互影响[6]。基于以上研究背景，本研究通过探究子宫切除术后患者阴道微生态变化与外周血Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)表达及细胞免疫炎症因子的关系，旨在进一步加深对阴道微生态失衡机制的认识，从而为临床针对性防治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 通过方便抽样法选取2021 年1~12 月西安国际医学中心医院收治的95 例行子宫切除术患者为研究对象。纳入标准：(1)均为腹腔镜下全子宫切除术患者；(2)术前1个月内无抗生素、微生态制剂、口服避孕药使用；(3)术前3 个月内无糖皮质激素、免疫抑制剂等应用；(4)术前均使用甲硝唑行阴道准备，术后均连续使用抗菌药物5~7 d；(5)精神正常。排除标准：(1)合并全身感染性疾病、免疫性疾病、恶性肿瘤、重要脏器功能不全者；(2)绝经期女性；(3)无法取得检查、研究配合；(4)糖尿病患者；(5)精神病史。95 例患者年龄36~56 岁，平均(43.14±6.78)岁；体质量指数19.5~28.9 kg/m2，平均(23.68±3.15) kg/m2；原发疾病：子宫肌瘤36 例，子宫腺肌症28 例，功能性子宫出血15 例，重度宫颈病变10 例，重度子宫内膜病变6 例。本研究经医院伦理委员会审核批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 阴道微生态检测及定义[7]于术前、术后1周，采用无菌长棉签采集阴道侧壁上1/3处阴道分泌物标本送检，主要检测内容：(1)阴道pH 值：采用精密pH 试纸直接测定阴道分泌物pH 值，pH 值≤4.5、>4.5分别视为正常、异常升高；(2)菌群密度：阴道分泌物涂片，干燥、固定，革兰染色后于油镜下(放大倍数10×100)观察阴道菌群，各视野平均细菌数1~9 个、10~99 个、100个及以上(光镜下细菌满视野)、细菌聚集成团或将黏膜上皮细胞密集覆盖分别分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级；(3)菌群多样性：涂片中可辨别细菌1~3种、4~6种、7~9 种、10 种及以上分别分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级；(4)乳杆菌数量：计数以油镜下各视野乳杆菌平均数为准，未见乳杆菌或仅1~5 个/Hp、6~15个/Hp、16~30个/Hp、>30 个/Hp 分别分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级。正常阴道微生态定义：阴道pH值3.8~4.5，阴道菌群密度Ⅱ级或Ⅲ级，菌群多样性Ⅱ级或Ⅲ级，优势菌为乳杆菌(即菌群中乳杆菌密度最大)。阴道微生态失衡：不符合上述正常定义中任意一条均视为微生态失衡。

1.2.2 TLR2、TLR4 表达 于术前、术后1 周，采集患者空腹静脉血标本5 mL，以3 000 r/min、离心半径10 cm 离心10 min，留取血清于-80℃下保存备用；采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，采用流式细胞术检测TLR2、TLR4 在CD14+细胞表面表达百分率；荧光标记抗体FITC-抗人CD14 单抗、APC-抗人TLR2单抗、PE-抗人TLR4单抗均出自美国eBioscience 公司，检测仪器为美国Beckman Coulter公司CytoFLEX LX型流式细胞仪。

1.2.3 细胞免疫炎症因子 取上述血清标本解冻后，采用酶联免疫吸附试验法检测Th1、Th2细胞因子水平，主要包括白介素-2 (IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)，试剂盒均出自美国BioVision公司。

1.3 观察指标 (1)对比患者手术前后阴道微生态变化，统计阴道微生态失衡率；(2)比较手术前后失衡组与正常组TLR2、TLR4 及细胞免疫炎症因子表达；(3)分析术后阴道微生态与TLR2、TLR4 及细胞免疫炎症因子相关性。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0 统计软件分析数据。计数资料比较行χ2检验，等级资料行秩和检验；计量资料呈正态分布，均数±标准差(±s)表示，组间比较行独立样本t检验；采用Spearman 相关分析法分析阴道微生态与TLR2、TLR4 及细胞免疫炎症因子的相关性；绘制受试者工作特征曲线(ROC)评估TLR2、TLR4及细胞免疫炎症因子对阴道微生态失衡的预测价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者手术前后的阴道微生态比较 术后1周，患者的阴道pH 值、菌群密度、菌群多样性、乳杆菌数量分级与术前比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；术后阴道微生态失衡率73.68%，明显高于术前的44.21%，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 95例患者手术前后的阴道微生态比较[例(%)]Table 1 Comparison of vaginal microecology in 95 patients before and after surgery[n(%)]

2.2 失衡组与正常组患者手术前后的TLR2、TLR4表达比较 术前，失衡组与正常组外周血TLR2、TLR4表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；术后1周，失衡组外周血TLR2、TLR4表达水平明显高于术前及正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 失衡组与正常组患者的TLR2、TLR4表达水平比较(±s，%)Table 2 Comparison of expression levels of TLR2 and TLR4 between imbalance group and normal group(±s,%)

表2 失衡组与正常组患者的TLR2、TLR4表达水平比较(±s，%)Table 2 Comparison of expression levels of TLR2 and TLR4 between imbalance group and normal group(±s,%)

注：与本组术前比较，aP<0.05。Note:Compared with the value in the same group before surgery,aP<0.05.

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2.3 失衡组与正常组患者手术前后的细胞免疫炎症因子比较 术前，失衡组与正常组患者的血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)；术后1周，失衡组患者的血清IL-2、TNF-α水平明显高于术前及正常组，IL-4、IL-10水平明显低于术前及正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 失衡组与正常组患者手术前后的血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平比较(±s，pg/mL)Table 3 Comparison of serum levels of IL-2, TNF-α, IL-4, and IL-10 between imbalance group and normal group before and after surgery(±s,pg/mL)

表3 失衡组与正常组患者手术前后的血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平比较(±s，pg/mL)Table 3 Comparison of serum levels of IL-2, TNF-α, IL-4, and IL-10 between imbalance group and normal group before and after surgery(±s,pg/mL)

注：与本组术前比较，aP<0.05。Note:Compared with the value in the same group before surgery,aP<0.05.

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2.4 术后阴道微生态与TLR2、TLR4及细胞免疫炎症因子的相关性 经Spearman 相关分析法分析结果显示，阴道pH 值与TLR4、IL-2、TNF-α表达呈正相关(P<0.05)；菌群密度、菌群多样性与TLR2、TLR4、IL-2、TNF-α表达均呈正相关(P<0.05)，与IL-4、IL-10均呈负相关(P<0.05)；乳杆菌与TLR2、TLR4、IL-2、TNF-α表达呈负相关(P<0.05)，见表4。

表4 术后阴道微生态与TLR2、TLR4及细胞免疫炎症因子的相关性(r值)Table 4 Correlation between postoperative vaginal microecology and TLR2,TLR4 and cellular immune inflammatory factors(r)

2.5 TLR2、TLR4 及炎症因子对阴道微生态失衡的预测价值 以是否诊断阴道微生态失衡为状态变量，以外周血TLR2、TLR4 表达水平及血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10 水平为检验变量绘制ROC 曲线，结果显示，TLR2、TLR4、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10 诊断阴道微生态失衡的ROC 曲线下面积分别为0.729、0.842、0.830、0.741、0.812、0.715 (P<0.05)。见图1 和表5。

图1 TLR2、TLR4及炎症因子诊断阴道微生态失衡的ROCFigure 1 ROC of TLR2, TLR4 and inflammatory factors in the diagnosis of vaginal microecological imbalance

表5 TLR2、TLR4及炎症因子对阴道微生态失衡的诊断效能Table 5 Diagnostic efficiency of TLR2,TLR4 and inflammatory factors on vaginal microecological imbalance

3 讨论

3.1 子宫切除术后阴道微生态失衡率升高 本研究结果显示，术后1 周，患者阴道pH 值>4.5 比例明显升高，菌群密度、菌群多样性、乳杆菌数量分级均下降，阴道微生态失衡率显著高于术前，提示子宫切除术可加重阴道微生态破坏。分析原因，正常情况下，乳杆菌是阴道优势菌群，可通过释放大量乳酸维持阴道偏酸性环境，其pH 值一般不超过4.5[8]。除乳杆菌外，阴道正常菌群中还包括棒状感觉、大肠杆菌、类杆菌、梭杆菌、肠球菌、加德纳菌、表皮葡萄球菌等细菌，维持着一定的菌群密度和多样性，不过其中95%左右为兼性和专性厌氧菌，这些细菌可通过自身黏附机制同阴道上皮细胞受体结合，并于阴道壁黏膜表面生长，这对参与宿主营养转化、调节免疫力、抑制外来病原菌生长、维持生殖健康等具有重要意义[9]。对行子宫切除术患者而言，为降低围生期感染风险，术前会行阴道擦洗换药，术后会常规预防性使用抗生素，这会导致阴道乳杆菌数量减少甚至消失，而且术后早期活动下降、阴道渗出液或积血难以顺利排出，可一定程度上中和阴道酸度，这些因素使得患者术后阴道pH无法维持在4.5以内；此外，手术创伤、麻醉刺激、术后免疫紊乱等等均不利于早期乳杆菌数量及菌群密度、多样性恢复，因此本研究患者术后阴道pH值>4.5比例升高，而菌群密度、菌群多样性、乳杆菌数量分级均下降，阴道失衡率大大升高。李辞妹等[10]研究显示，全子宫切除术后患者乳杆菌数量、阴道pH 值、菌群多样性、菌群密集度分级均明显下降，而给予乳杆菌干预能促进阴道微生态恢复，这与本研究有相似之处。

3.2 阴道微生态失衡与TLR2、TLR4表达呈正相关 TLRs作为机体感知包括细菌、病毒、真菌等多种病原体入侵的膜受体家族，在机体固有免疫中扮演重要角色，由TLRs 介导的免疫炎症反应与女性生殖系统多种炎症性疾病关联密切[11]，而阴道微生态在女性生殖系统相关疾病发生、进展全程中也起重要作用[12]，因此TLRs表达可能与女性阴道微生态有关。本文结果显示，阴道微生态失衡组外周血TLR2、TLR4表达百分率较术前明显升高，且高于正常组，提示TLR2、TLR4异常升高可能参与阴道微生态失衡发生。TLR2、TLR4是TLRs家族最具代表性成员，其中TLR2可识别的特异性配体最为广泛，其外源性配体主要包括革兰阳性菌及其细胞壁肽聚糖、脂磷壁酸等成分，TLR4是最早发现也是当前研究最多的TLR，其外源性配体主要为革兰阴性菌脂多糖[13]。研究发现，孕妇微生态失衡率较正常育龄女性明显升高，且孕妇阴道灌洗液TLR2 表达明显高于正常育龄女性[14]；还有研究指出，血清TLR2 在宫颈癌继发阴道感染者表达明显升高，检测其水平对阴道感染具有较高诊断价值[15]；上述研究也提示TLR2异常表达可能与女性阴道微生态失衡或阴道感染有关。文献显示[16]，无症状白假丝酵母菌携带者、有症状阴道念珠菌感染者内皮细胞TLR4 表达水平明显高于健康受试者；还有报道认为，乳杆菌可通过下调TLR4 mRNA 和蛋白表达，降低阴道炎症反应；上述研究均提示，TLR4 与阴道微生态变化有关[17]。故阴道微生态失衡组TLR2、TLR4 表达升高。本研究相关性分析显示，阴道pH 值与TLR4、呈正相关，菌群密度、菌群多样性与TLR2、TLR4均呈正相关，乳杆菌与TLR2、TLR4呈负相关，进一步证实子宫切除术后患者阴道微生态与TLRs 表达有关。此外，ROC曲线结果显示，TLR2、TLR4诊断阴道微生态失衡的ROC曲线下面积分别为0.729、0.842，提示检测TLR2、TLR4 对子宫切除术后患者阴道微生态失衡有一定预测价值。

3.3 阴道微生态与细胞免疫炎症因子有相关性 Th1 细胞主要通过介导和刺激细胞免疫、细胞毒性T细胞等，参与对抗细胞内细菌及原虫的免疫反应；Th2 细胞则主要介导B 细胞增殖抗体生成，刺激体液免疫，正常情况下，Th1/Th2 细胞处于动态平衡状态，Th1/Th2 平衡失调与多种妇产科疾病有关[18]。IL-2、TNF-α是Th1 细胞的代表细胞因子，IL-4、IL-10 为Th2细胞的代表细胞因子，本文结果显示，失衡组术后血清IL-2、TNF-α水平较术前及正常组显著升高，而IL-4、IL-10 水平显著降低，提示细胞免疫炎症因子表达失衡可能与阴道微生态失衡有关。研究认为[19]，阴道微生态菌群可参与宿主细胞免疫、体液免疫形成，当阴道益生菌相对丰度下降、致病菌相对丰度升高时，阴道可出现Th1/Th2免疫平衡紊乱，使得阴道屏障功能减弱，进而增加阴道感染风险。行相关性分析发现，阴道pH值与IL-2、TNF-α呈正相关，菌群密度、菌群多样性与IL-2、TNF-α表达均呈正相关，与IL-4、IL-10 均呈负相关，乳杆菌与IL-2、TNF-α呈负相关，进一步证实子宫切除术后患者阴道微生态与细胞免疫炎症因子有关。林雪珊等[20]研究发现，先兆流产患者阴道微生态与Th1/Th2 细胞因子有关，与本研究相似。此外，本研究发现，IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10诊断阴道微生态失衡的ROC 曲线下面积分别为0.830、0.741、0.812、0.715，提示检测细胞免疫炎症因子对子宫切除术后患者阴道微生态失衡有一定预测价值。

结合本文结果可有以下提示：一，应重视子宫切除术后患者阴道微生态平衡评估和调节；二，TLR2、TLR4 表达及Th1/Th2 免疫失衡靶向调节或许在阴道微生态失衡改善乃至相关妇科炎症疾病治疗中有应用前景，当然这有待于更多研究给予证实。

综上所述，子宫切除术后患者阴道pH、菌群密度、多样性、乳杆菌等微生态均发生改变，阴道微生态失衡率升高，且与患者TLR2、TLR4 及细胞免疫炎症因子表达有关。