西南典型种植区蔬菜重金属健康风险评估

田 稳，汪 洁，岳志强，马娇阳，李梦莹，王健敏，徐武美，向 萍*

（1 西南林业大学生态与环境学院 昆明 650224 2 玉溪市农业环境保护和农村能源工作站 云南玉溪 653199 3 云南省农村科技服务中心 昆明 650021 4 云南师范大学能源与环境科学学院 昆明 650500）

重金属广泛存在于环境介质中，因具有不可降解性、高毒性、强隐蔽性、半衰期长以及易通过食物链在人体和动植物体内积累等特点，其含量被认为是评价生态环境质量和食品安全的一项重要指标，受到全世界的广泛关注[1]。全国土壤污染状况调查[2]结果显示，全国土壤总的点位超标率为16.1%，重金属镉（Cd）、砷（As）、铅（Pb）、铬（Cr）的点位超标率分别达到7.0%，2.7%，1.5%和1.1%。

蔬菜是人类饮食的重要组成部分，种植区土壤重金属污染往往导致蔬菜中重金属的含量超标，从而增加人体摄入的风险。张芹等[3]研究发现来自昆明市盘龙区周边农田的青椒、白菜等10 种蔬菜受到不同程度Cd 污染，在各类蔬菜中，芸薹类Cd 污染最为普遍，超过55.6%的蔬菜品种被污染。丽江高背景区蔬菜中Cr 的平均含量为1.1 mg/kg，有50%蔬菜样品Cr 超标，食用古城区和玉龙县的蔬菜存在Cr 潜在健康风险[4]。穆德苗等[5]研究发现，试验区域种植的蔬菜样品中有20.49%重金属Pb 超标，主要为根茎类和叶菜蔬菜，而土壤Pb 的超标率为68.40%。Zhong 等[6]基于220 篇已发表的论文，评估我国蔬菜重金属摄入的健康风险，结果表明，生活在云南的人群面临着蔬菜中Cd 和Pb 造成的健康风险。

研究表明，许多疾病与重金属暴露有关，重金属超标的食品对人体健康具有严重的威胁[7]。如Cd 具有内分泌干扰效应，长期接触会增加人体患肺癌、胃肠癌、前列腺癌，内分泌失调和心血管疾病[8-10]等疾病的风险；Pb 会损害肾脏和生殖系统，影响智力表现[11]；急性As 中毒对人体的影响包括呕吐、腹痛和腹泻，而长期接触As 可能导致各种类型的癌症[12]。准确评估重金属人体摄入后的健康风险成为当下的研究热点。

目前，基于重金属总量的健康风险评价模型广泛应用于蔬菜中，然而，蔬菜中所有重金属并非都会被人体吸收[13]。基于总量的评价方法往往高估其健康风险。近年来，基于蔬菜中重金属在进入人体胃肠道后，可被吸收的最大溶出量（生物可给性）的评价方法受到广泛关注，然而，蔬菜中重金属健康风险的精细化评估以及生物可给态重金属对人体胃肠道上皮细胞的毒性效应鲜有报道[6，14]。

本研究以我国西南典型蔬菜种植区玉溪市3个县/区的土壤-蔬菜为研究对象，通过测定土壤及蔬菜可食用部分的重金属含量，厘清土壤-蔬菜系统重金属的污染特征；分析蔬菜中重金属的生物可给性；计算基于总量和生物可给性的目标危险系数（THQ），比较分析蔬菜的人体健康风险；同时，借助人体肠道上皮细胞Caco-2 研究生物可给态重金属对人体的健康危害，进一步验证其健康风险的准确性。本研究旨在为准确评估蔬菜中重金属的人体健康风险提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于云南省中部的玉溪市红塔区、通海县和元江县境内，年平均气温17.4～23.8 ℃，年均降水量670～2 412 mm，属中亚热带湿润冷冬高原季风气候。地势西北高，东南低，大部分地区海拔在1 500～1 800 m 之间，最高海拔3 137 m，最低海拔328 m。以赤红壤和红壤为主，主要种植蔬菜、水果等作物，是云南省重要的蔬菜主产区。

1.2 土壤和蔬菜样品的采集

土壤和蔬菜样品的采集在2021年4～5月进行。共采集了来自红塔区、通海县和元江县周边农田种植的蔬菜及对应的表层土壤（0～20 cm）样品36 对，其中白菜6 对，西蓝花、西红柿各5 对，小葱3 对，大蒜、鱼腥草、韭菜、豌豆各2 对，牛皮菜、苤蓝、苋菜、辣椒、玉米、茴香、蚕豆、蕨菜、四季豆各1 对。所有样品保存至自封袋，并在采样当天运送到实验室。蔬菜样品取可食部分先用自来水洗净，再用蒸馏水清洗3 次，晾干表面水分，匀浆备用。土壤样品去除石头、地膜等杂质自然风干，过筛备用。

1.3 仪器与试剂

浓硝酸（优级纯级），美国默克公司；30%过氧化氢（分析纯级），天津风船化学试剂科技有限公司；猪胆盐，上海麦克林生化科技有限公司；胰酶，上海源叶生物科技有限公司；MEM 基础培养基、胎牛血清、青酶素-链霉素、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液，武汉普诺赛生命科技有限公司。

E-max500 X 荧光重金属分析仪（XRF），美国XOS 公司；ICAPRQ 电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）、FormaTMSteriCycleTM二氧化碳培养箱，美国Thermo Fisher 公司；尼康TS-100 倒置生物显微镜，日本Nikon 公司；96 孔细胞培养板，美国Corning 公司；SpectraMax Plus 384 酶标仪，美国Molecular Devices 公司。

1.4 样品的分析

1.4.1 土壤、蔬菜样品重金属含量的测定 土壤样品中重金属As、Pb、Cr 和Cd 的总量参照Kodom等[15]的方法使用XRF 测定；蔬菜样品中重金属总量采用美国环境保护署3050B 方法，用浓硝酸（HNO3）和30%过氧化氢（H2O2）消解样品（2.000 g，鲜重），并使用ICP-MS 测定重金属As、Pb、Cr和Cd 含量。每个土壤及蔬菜样品均设置3 个平行。

1.4.2 蔬菜生物可给性的测定 基于GB 2762－2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量标准》[16]筛选部分重金属含量较高的蔬菜，使用体外胃肠模拟（SBRC）法测定其生物可给性[17]。取5.0 g新鲜蔬菜样品于50 mL 离心管中，加入模拟胃液至30 mL，调节溶液pH 值为1.5，置于振荡器中以150 r/min 的速度在37 ℃下振荡1 h，期间保持pH值不变，振荡结束后以4 000 r/min 的速度离心10 min，将上清液转移到另一个离心管中。然后向残渣中加入模拟肠液30 mL，调节溶液pH 值为7，在37 ℃下以150 r/min 的速度振荡4 h，期间保持pH 值不变，后以4 000 r/min 离心10 min 并吸取上清液。胃、肠相模拟上清液通过0.45 μm 滤膜后，用ICP-MS 测定重金属含量。每个样品重复测定3 次，并设置胃液和肠液的空白对照。

生物可给性（BA）由公式（1）计算[18]。

式中，Civ——蔬菜样品胃/肠模拟消化后释放出的重金属元素含量，mg/kg；Ct是蔬菜样品中重金属元素总含量，mg/kg。

1.5 环境和健康风险评价

1.5.1 土壤环境评价 采用单因子污染指数（PI）来评价土壤的污染程度，根据公式（2）进行计算。

式中，PIi——污染物i的单因子污染指数；Ci——所测土壤中污染物i的含量（mg/kg）；Si为土壤中污染物i的标准含量（mg/kg），为《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618-2018）[19]中的土壤污染风险筛选值。

当PIi<1 时，表示土壤未受污染，处于清洁水平；1≤PIi<2 时，土壤处于轻度污染水平；2≤PIi<3时，土壤处于中度污染水平；当PIi≥3 时，表明土壤受到严重污染，为重度污染水平。

1.5.2 蔬菜健康风险评价 本研究采用目标危害系数（THQ）法[20]来评估暴露于蔬菜中重金属的人体健康风险。THQ 是以污染物暴露剂量与参考剂量的比值来表征非致癌风险水平，如果THQ>1.0，则说明该污染物对人体具有潜在健康风险。计算方法见式（3），公式中各参数取值如表1所示。

表1 THQ 计算参数取值Table 1 Parameter values in THQ calculation

式中，EF——年均暴露频率，d；ED——暴露持续时间，年；FIR——每日摄取速率，mg/d；C——蔬菜中重金属含量，mg/kg；RFD——参考剂量，mg/（kg·d）；WAB——人体平均体重，kg；TA——平均暴露时间，d。

此外，不同重金属在蔬菜中往往同时出现，这些重金属进入人体后会产生共同作用，总目标危害系数（TTHQ）可以表示重金属的复合污染风险，若TTHQ>1，说明人体可能受到重金属的危害，其计算方法如下：

式中，THQi为第i种重金属的目标危害系数。

1.6 细胞培养、暴露与及活力测定

人体结肠上皮细胞Caco-2 来自美国模式培养物寄存库（ATCC），将细胞接种在含完全培养基（MEM 基础培养基、10%胎牛血清和1%青酶素-链霉素）的培养皿中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞增殖至80%时用胰蛋白酶消化传代[24]。将1.4.2 节中的蔬菜肠相模拟液于90 ℃的水浴锅中加热10 min，以使相关消化酶和部分微生物变性，再过0.22 μm 灭菌滤膜备用，灭菌后的肠相模拟液和MEM 基础培养基以体积比1∶1 的比例配制细胞暴露液，以测定蔬菜肠相模拟消化液中溶出的生物可给态重金属对Caco-2细胞活力的影响，将Caco-2 细胞以每孔8 000 个/100 μL 的密度接种于96 孔板中，待细胞生长24 h 后，吸弃孔内的完全培养基，向每孔加入100 μL 现配的细胞暴露液，于细胞培养箱中分别孵育4 h 和8 h，然后利用显微镜观察细胞形态。随后，使用CCK-8 细胞活力测定试剂盒检测细胞活力的变化，从而分析蔬菜肠相模拟液的肠道细胞毒性[25]。

1.7 数据处理

本文数据均采用平均值和标准差进行汇总，使用Microsoft Excel 2010 和GraphPad Prism 8.0对数据进行整理、分析。

2 结果与讨论

2.1 土壤重金属污染特征

研究区土壤重金属含量变化特征和污染程度如图1所示。通海县、红塔区和元江县（以下简称通海、红塔、元江）蔬菜种植区土壤4 种重金属平均含量大小顺序均为Cr>Pb>As>Cd，Cr、As、Cd、Pb在通海菜地土壤中的含量均高于红塔和元江，且Cd 含量超标最严重。通海菜地Cr、As、Cd、Pb 的平均含量均超过了云南省土壤背景值[1]，红塔菜地Cr、Cd 和Pb 的平均含量也都不同程度地超过了云南省土壤背景值，而元江菜地仅有Cr 和Cd 的平均含量超过云南省土壤背景值，说明4 种重金属在研究区部分土壤中已经存在一定程度的积累，特别是Cd 和Cr 在通海、红塔和元江菜地中都有积累，这与李洋等[23]和卢维宏等[4]的研究结果一致。以《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618-2018）中的风险筛选值（以下简称筛选值）为标准值，通海菜地As、Cd 和Pb的平均污染指数分别为1.09，5.19 和1.14，说明As 和Pb 处于轻度污染水平，而Cd 则达到重污染水平，另外，红塔菜地土壤Cd 也处于轻度污染水平。这与南方蔬菜地Cd 作为污染最严重的重金属元素的研究结果一致[26]。研究表明，玉溪市处于Cd异常带，自然背景值高，而元江土壤重金属元素背景值较低[27-28]。自然背景、化肥的施用和地膜覆盖可能是通海和红塔土壤Cd 污染的主要原因[29-30]。相比之下，元江菜地土壤处于清洁水平。

图1 研究区土壤重金属污染特征Fig.1 Soil heavy metal pollution characteristics in the study area

2.2 蔬菜重金属污染特征及健康风险评价

2.2.1 蔬菜重金属含量特征 各类蔬菜中4 种重金属Cr、As、Cd、Pb 含量见表2。通海、红塔和元江蔬菜中Cr 的平均含量分别为0.14，0.14，0.16 mg/kg；As 的平均含量分别为0.11，0.08，0.13 mg/kg；Cd 的平均含量分别为0.22，0.04，0.00 mg/kg；Pb的平均含量分别为0.04，0.08，0.09 mg/kg。与GB 2762－2017《食品安全国家标准食品中污染物限量标准》（以下简称限量值）相比，通海、红塔和元江的叶菜、芸薹类、根茎类、豆类和茄果类蔬菜中Cr、As 和Pb 的含量平均值均未超标，而此次在通海和红塔采集的芸薹类蔬菜中Cd 的含量分别超出限量值13.6 倍和2.2 倍。

表2 蔬菜中重金属含量Table 2 The concentrations of heavy metals in vegetables

通海、红塔和元江种植区土壤Cr 的含量均未超出筛选值，说明土壤中Cr 对蔬菜造成的污染风险较低，符合通海、红塔和元江蔬菜中Cr 含量低于限量值的结果[19]。然而，通海、红塔和元江蔬菜与土壤中Cr 的含量无相关性，可能是因为土壤-蔬菜系统Cr 的吸收受许多因素的控制，土壤Cr虽高，但常以还原态Cr（Ⅲ）存在，不易被吸收，从而导致蔬菜中Cr 的含量较低[31]。此外，作物根部比叶片和果实更易积累Cr，这可能是根茎类蔬菜Cr 含量更高的主要原因[32]。当土壤中重金属的含量超过筛选值时，蔬菜从土壤中吸收营养物质的过程中，重金属也被吸收进入蔬菜体内，对蔬菜安全可能存在一定的风险[19，33]。研究区部分蔬菜Cd和As 的含量不同程度地超过了限量值，另外，Cd作为我国土壤重金属污染点位最多的元素，容易被多种蔬菜富集[34]。通海、红塔和元江研究区各类蔬菜Cd 含量的高低顺序均为通海>红塔>元江，与土壤Cd 的含量有很好的相关性（R2=0.992），通海芸薹类蔬菜Cd 含量最高，与叶劲松等[35]的研究结果相似。值得注意的是，元江菜地土壤As 含量为15.63 mg/kg，低于筛选值，而根茎类蔬菜中As 的含量存在较大差异，其中鱼腥草As 含量为0.89 mg/kg，超出限量值（0.5 mg/kg），可能是因为鱼腥草易吸收和富集土壤中的As[36]。相比之下，通海、红塔和元江蔬菜Pb 含量均未超出限量值，元江豆类蔬菜Pb 含量在所有蔬菜中最高，与前人研究结果一致[35]。红塔叶菜Pb 含量也相对较高，但土壤Pb 含量并未超出筛选值，这可能是大气沉降所致，其已被证实是城市或工业区附近叶菜Pb 积累的主要原因[37]。

2.2.2 蔬菜中重金属的生物可给性分析 基于蔬菜重金属总量，选取部分重金属含量（As 和Cd）相对较高的蔬菜（西兰花、白菜、鱼腥草）以评价蔬菜中重金属的生物可给性，如表3所示。通海西兰花a、西兰花b 和白菜中Cd 在胃阶段的生物可给性分别为31.47%，41.32%和9.84%，而在肠阶段生物可给性明显降低，分别为0.61%，1.20%和0%。Intawongse 等[38]的研究表明，Cd 在胃阶段的生物可给性高于小肠阶段，而在胃阶段或小肠阶段Cd的生物可给性很大程度上取决于蔬菜种类中的Cd 的总浓度。Hu 等[39]研究表明，香港市售蔬菜Cd在胃阶段的生物可给性在14%～71%范围，肠阶段Cd 的生物可给性在7.1%～25%范围，同样胃阶段到肠阶段的生物可给性呈现递减的趋势。研究表明，进入作物的Cd 除了积累在细胞壁之外，大部分存储在液泡，因此Cd 很易从组织中释放出来[40]。此外，强酸性可能导致金属与碳水化合物和蛋白质之间的化学键断裂，从而导致Cd 在胃阶段大量释放，因此Cd 在胃阶段的生物可给性要明显高于肠阶段[41]。元江鱼腥草As 在胃阶段的生物可给性为25.23%，肠阶段的生物可给性明显下降（6.69%）。以上研究结果说明这些蔬菜中的重金属并非全部会在胃肠道环境中溶出，也提示基于总含量的风险评价可能会高估其健康风险。

表3 蔬菜中As、Cd 的生物可给性Table 3 Bioaccessibility of arsenic and cadmium in vegetables

2.2.3 基于总量和生物可给性的蔬菜中重金属人体健康风险评价比较 目前关于蔬菜重金属的人体健康风险评价多以总含量为主。如Kumar 等[42]对印度勒克瑙市294 份蔬菜样品进行了健康风险评估，结果表明当地居民通过食用从当地蔬菜市场获得的被重金属污染的蔬菜，存在长期的健康风险。Nancy 等[43]通过目标危害系数（THQ）和危害指数（HI）评估了农业区种植蔬菜的人体健康风险，发现研究区蔬菜虽没有潜在的健康风险，但是韭菜、薄荷和香菜中的As 致癌风险对成人和儿童都很高。近年来，也有专家提出以生物可给性对蔬菜中重金属的健康风险进行评价将更为准确。如Li 等[25]基于重金属总量和生物可给性评估了云南不同地方甘蓝的食用健康风险，结果表明基于总量计算As、Cd、Pb 和Cr 的每日估计摄入量（EDI）分别为0.43，0.36，0.57 和2.29，而以生物可给性计算得出的EDI 明显降低，分别为0.05，0.03，0.45和1.99。基于此，本文分别对蔬菜中重金属的总量和人体胃肠阶段的生物可给性进行了分析，更加精细地评价了蔬菜中重金属的人体健康风险。

研究区各类蔬菜重金属的健康风险（成人）的THQ 和TTHQ 值见表4。总体来看，通海、红塔和元江蔬菜4 种重金属的THQ 平均值由大到小排列依次为Cd>As>Pb>Cr、Cd>As>Pb>Cr、As>Pb>Cr>Cd，这说明对于通海和红塔来说，Cd 是蔬菜摄入健康风险的最主要元素，而对于元江，As 是当地蔬菜摄入健康风险的最主要元素。此外，通海蔬菜Cd 的THQ 平均值大于1，其中芸薹类蔬菜的THQ 高达3.40，说明此次采集的芸薹类蔬菜Cd存在较高的潜在健康风险，是通海蔬菜摄入健康风险的主要来源。前人的研究中，叶菜蔬菜Cd 含量通常高于其它蔬菜[23]，本研究芸薹类蔬菜Cd 含量高于其它类蔬菜的原因可能是采样时西兰花未完全成熟，有部分西兰花叶作为可食部分，而这部分叶可能富集了Cd。TTHQ 均值由大到小排列为：通海>红塔>元江。其中，通海的TTHQ 为1.34，大于1，说明可能存在一定的健康风险，该风险主要来自于Cd。值得关注的是，通海叶菜蔬菜、红塔芸薹类蔬菜和元江根茎类蔬菜的TTHQ 分别为0.91，0.71，0.69，主要贡献元素为Cd 或As，虽然TTHQ 都小于1，但人体长期暴露在Cd、As 污染环境中会发生重金属毒害作用，进而引发癌症、神经系统毒性、骨质疏松、肝肾损伤、生殖毒性、肺部损伤等疾病[12，44]，其食用健康风险仍然不可忽略。此外，由于样品数量和批次有限，还需要多研究区域连续采样，以期获得更为准确全面的结论。

表4 基于蔬菜重金属总量的THQ 和TTHQ 值Table 4 THQ and TTHQ values of vegetables based on total heavy metals

基于胃肠阶段生物可给性的健康风险评价结果见表5，从表中可以看出，尽管选择了重金属总量较高的蔬菜，其胃肠阶段生物可给性的THQ 也远低于基于总量的THQ，在含量相对较低的白菜肠模拟液中甚至未检出重金属。与耿紫琪等[45]的研究结果相似。基于生物可给性对蔬菜中As 和Cd 进行的健康风险评估均未存在风险，说明基于重金属总量的健康风险评价可能会高估蔬菜的健康风险，基于体外胃肠模拟方法来评估蔬菜的健康风险可能更有效、更科学合理[40，46]。

表5 基于蔬菜As、Cd 生物可给性的THQ 值Table 5 THQ values based on the bioaccessibility of As and Cd in vegetables

2.3 基于生物可给性人体健康风险的肠道细胞毒性效应验证

基于生物可给性研究农作物的健康风险相较于总量的评价方式更被人们接受，然而生物可给态重金属是否一定对胃肠道细胞产生健康毒性效应仍然鲜有研究。最近的研究发现，基于生物可给性数据评定有健康风险的蔬菜并不会对人体胃上皮细胞（SGC-7901）产生毒性效应[25]。细胞活性的变化可以准确地评估外源污染物对人体造成的健康危害，也是反映重金属造成细胞毒性的一项重要指标[47]。因此，为了精确评估其健康风险，本文分析了生物可给态肠相提取液（以下简称肠液）是否会对人体肠道细胞产生毒性效应。结果如图2所示，3 种蔬菜（4 个蔬菜样品）肠液暴露细胞4 h和8 h 对细胞活力影响不大，这可能是因为细胞有不同的途径应对环境污染物，以免受外源性应激，而肠液中重金属浓度低，因此不足以对细胞产生毒害作用[48]。值得注意的是，白菜肠液分别暴露4 h 和8 h 后的细胞活力均高于另外3 个蔬菜样品，这与基于生物可给性的健康风险评价结果一致。此外，西兰花a 和白菜的肠液暴露8 h 后Caco-2 细胞的活力均高于4 h，而西兰花b 和鱼腥草肠液暴露4 h 和8 h 后的细胞活力几乎相同，可归因于蔬菜种类和细胞类型的差异[25]。本研究中，人体肠道细胞毒性效应验证了基于生物可给性的健康风险评价结果，因此生物可给性和细胞模型相结合的方法更能够精细、准确的评估蔬菜中重金属对人体的健康风险。

图2 不同蔬菜肠液暴露4 h 和8 h 后Caco-2 细胞活力Fig.2 The viability of Caco-2 cells exposed to different vegetable intestinal fluids for 4 h and 8 h

3 结论

1）通海蔬菜种植区土壤Cr、As、Cd、Pb，红塔Cr、Cd、Pb，元江Cr、Cd 的平均含量均超过云南省土壤背景值。土壤环境评价结果显示，通海菜地土壤受到重金属As、Cd 和Pb 的污染；红塔受到Cd轻污染；元江暂未受到4 种重金属的污染。

2）通海、红塔和元江的叶菜、芸薹类、根茎类、豆类和茄果类蔬菜中Cr、As 和Pb 的含量均未超出规定的限量值，但此次在通海和红塔采集的芸薹类蔬菜中Cd 的含量超出了限量值。

3）西兰花a、西兰花b、白菜和鱼腥草4 个蔬菜样品As 和Cd 的生物可给性在0%～41.32%之间，肠阶段的生物可给性低于胃阶段。

4）基于重金属总量的TTHQ 均值由大到小排列为：通海（1.34）>红塔（0.36）>元江（0.28），提示食用超限量值的通海蔬菜可能会有一定的健康风险。芸薹类蔬菜Cd 是造成通海和红塔居民健康风险的主要来源，而根茎类蔬菜As 是元江居民健康风险最主要的贡献者。

5）基于生物可给性的健康风险评价发现3种蔬菜均不存在潜在的健康风险，细胞毒性研究验证对肠道也没有健康风险。基于总量的健康风险评价模型可能高估了蔬菜中重金属的健康风险。