猪性控精液技术应用研究的进展

宋宇伦，冯赫泽，周彦芝，李 远，魏国生 ，李井春

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

我国是人口大国，也是肉制品消耗大国，据了解，近10年我国人均肉制品年消耗量从30多千克增至60多千克，为了解决畜牧业畜禽数量、产量等的实际问题，利用性别控制技术促进畜牧业的发展尤为必要。性别控制技术是一项现代生物技术，通过人为参与选择分离X、Y精子，最终得到所需性别的后代，具有非常重要的理论与现实意义。首先，性别控制技术能够充分发挥公畜生长速度、肉质性能，母畜的繁殖、泌乳性能，从而获得巨大的经济效益；其次，能够增强优良性状强度，加快育种进程，降低育种成本，以获得最大的遗传进展；此外，还可以通过控制后代的性别克服孪生不育等现象，并排除伴性有害基因的危害等问题。性控精液能够通过分离冷冻的精液选择性别进行输精，最终达到生产所需的目的，因此，高效准确的分离性控精液成为性别控制技术的重点研究方向之一，在畜牧生产中，性控技术的研究具有非常重要的实际生产价值。

目前，国内外的科研人员针对于性控精液分离的方法及胚胎性别鉴定进行了大量的研究，其中主要集中在以下几种方法。

1 Percoll密度梯度离心法

Percoll密度梯度离心法是指在离心过程中，由于X、Y精子在分离介质中的沉降速度不同，导致所处密度梯度不同，经过一段时间后最终分离精子的方法。S Kaneko等使用Percoll 密度梯度离心分离人X、Y精子时，正常精子和少精症精子中含有Y精子的比例分别为46.7%和46.6%，且分离后精子仍具有活力。曹世祯等研究表明，利用Percoll不连续密度梯度分离奶牛定性精液，所获精液的后代性别比例差异显著，其中富含X精子的定性精液后代雌性占比均在60%以上。Percoll密度梯度离心技术操作简单，成本低，但在离心过程中，精子细胞容易产生高浓度的活性氧（ROS），损害精子活力，降低精子完整性。

2 流式细胞仪分离法

流式细胞仪分离精子是根据X、Y精子之间的DNA含量差异进行分离。在分离X、Y精子时，常用的荧光染色剂为Hoechst33342，经过染色的精子会发光的为活精子，由于X精子的DNA含量高，结合的染色剂多，因此发光强度高于Y精子，导致激光系统被激活，使荧光信号转化成电信号，从而对两种不同的精子附上不同的正负电荷，最终落入不同的收集管中完成分离。宋林等利用流式细胞仪分离奶牛精子受胎后，对性别比例的影响较大，但分离解冻后的精子活力较原精活力低。熊显荣等在使用流式细胞仪的基础上添加诱惑红，使质膜不完整的精子着色淘汰，能显著增强分选后牦牛精子的活力，在一定程度上能够提高性控冻精的受胎率。但增有权等在使用流式细胞仪分离猪精子进行受胎后，输Y精子产仔率100%，输X精子产仔雌性率为91.67%，但窝产仔数呈下降趋势。流式细胞仪分离X、Y精子是目前在实际生产中被大规模应用的分离技术，但在分离猪精液方研究用较少，未来还需对分离猪精液开展进一步研究。

3 免疫法分离X、Y精子

Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，能够识别特定的病原体，在哺乳动物精子中表达，并通过干扰精子获能和过度激活精子活力来损害精子受精。目前已经发现的TLRs家族成员有11个，其中TLR7/8只在X染色体上表达。Umehara等研究表明，X染色体编码的TLR7/8在X精子中部和尾部表达，而在Y精子中不表达。Umehara等进一步将TLR7/8用于分离小鼠精子，在添加R848配体的条件下，小鼠的X、Y精子活力差异显著，溶液中显示分层状态，X精子的活力受到抑制，处于下层，当清除R848后，X精子活力被恢复，且仍然具备受精能力。Fa Ren等在奶山羊分离X、Y精子中使用TLR7/8受体时得到同样的结果，并且证明TLR7/8能够直接调节奶山羊的ATP水平来影响X精子活力。刘伟东研究表明，在肉牛精子中TLR7/8激动剂R848能够显著降低X精子的运动性能，但对精子顶体完整性和质膜完整性没有明显影响，且利用R848对肉牛鲜精进行分选，分选后Y精子纯度可以达到88.6%，X精子纯度可以达到72.5%。TRL7/8分选精子虽然准确率不高，但操作简单方便，试验过程中不损伤精子，不需要昂贵的设备，节省生产成本。目前在分离牛、羊、小鼠中已经展开相关研究，但在分离猪精子的研究中还处于空白状态，在今后的研究中具有很大的发展潜力。

4 PCR法鉴定胚胎性别

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外扩增技术。在进行胚胎性别鉴定时，通常选择Y染色体上的性别特异基因（如SRY基因）进行扩增，根据是否可以扩增特异基因来判断胚胎性别。目前胚胎鉴定的PCR法主要有常规PCR、巢式PCR、双重和多重PCR。孙俊丽等利用巢式PCR技术，对猪X和Y染色体上牙釉质基因（Amelogenin gene，AMEL）进行胚胎性别鉴定，试验结果显示，经PCR产物片段扫描后雌性胚胎只有一个峰值，雄性胚胎有两个峰值。尹智等利用SRY和zfy/x基因的特性，采取双重PCR技术对6只30 d左右的猪胚胎的性别进行鉴定，结果显示SRY序列扩增后，一个样品出现两个扩增带为雄性，剩余无特异扩增带为雌性。李小平等根据猪的SRY基因和GAPDH基因序列合成两对引物，通过双温多重PCR技术对猪进行早期胚胎性别鉴定，结果显示只能扩增GAPDH基因片段的为母猪，对SRY基因片段和GAPDH基因片段都能够扩增的为公猪，且试验中减少一步程序，可进一步缩短试验时间，减少精子损伤。

5 展望

性别控制技术对畜牧业的发展有着重要意义。当前性别控制技术正在逐步完善，许多存在的问题都已被解决，但仍有部分技术难题一直存在，如损伤精子、分离时间长等，阻碍畜牧业的发展。流式细胞仪在性别控制技术中被广泛应用，但对于猪性控精液的发展和应用还不成熟。利用TLR7/8在X、Y精子中的蛋白表达差异进行精子分离的试验中取得了较好的成绩，可望在日后的研究及生产中得到更多的运用。目前对于猪性控精液的研究与应用，相较于牛羊等产业还处于落后状态，但随着科技的进步和新技术的发掘，相信一定能够填补空缺，促进畜牧业更好的发展。