杨树抗寒分子机理研究策略

杨成超

(辽宁省杨树研究所，辽宁 营口 115213)

温度是决定植物地域分布的主要限制因子，全世界每年因低温对植物造成的经济损失达数十亿元。杨树是多年生木本植物，较早完成基因组测序，是开展抗寒分子机理研究的模式树木，是耐冻融分子机制研究的理想材料。杨树冻融伤害分为可逆冻融伤害和不可逆冻融伤害，有效冻融伤害的累积效应是杨树越冬死亡的主要原因[1，2]。杨树具有在可逆冻融伤害后自我修复的能力是其最终能从冬季严寒中存活下来的关键，杨树抗寒分子机理研究对杨树抗寒育种具有重要意义。

杨树响应低温胁迫分为几个阶段：信号感知(signal perception)、信号转导(transduction)、次级信号(Secondary signals)和靶基因响应(target-responses)等。近20年来，树树抗寒机理研究进展缓慢，主流观点是20世纪的细胞膜结构和功能伤害及活性氧导致的氧化性损伤。一般认为，细胞膜最先感知到环境温度变化，将信号传递到胞内。此外，组蛋白激酶、钙离子通道及磷脂酶等都可能扮演着次级温度感受器的角色。研究人员长期专注于抗冻锻炼阶段冷胁迫和零下轻度冻胁迫的冷信号感知及冷信号传导机制研究，例如Chen J等[3]对4 ℃和-4 ℃处理的胡杨(Populuseuphratica)叶片的转录组研究和Yang X Y 等[4]对4 ℃处理的毛白杨(P.tomentosa)叶片的转录组研究，而对较低温度(如-40 ℃)冻胁迫阶段的研究未见报道。

1 杨树细胞外和细胞内冰点精确测定

杨树冻害指冰点以下低温造成的伤害。冰点分为胞外冰点和胞内冰点。研究表明，胞外冰点可能造成细胞损伤，但一般不致死，而胞内结冰会造成细胞死亡。另外，有效冻融伤害的累积超过抗冻融度，也会造成组织死亡[1]。因此，要研究杨树可逆冻融伤害修复，首先要精确测定胞外冰点和胞内冰点温度，然后是有效冻融伤害的阈值[2]。

当前的杨树抗寒评价技术主要是测定相对电导率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖等生理指标。根据相对电导率确定的半致死温度不是细胞冰点，现在缺乏可精确测定细胞冰点的新技术来确定杨树在抗寒锻炼期、深度休眠期和脱锻炼期胞外和胞内冰点。该项技术研究将为杨树抗寒性精确评价和冻融伤害修复分子机理研究奠定基础。

2 冻融伤害修复与膜再密封

洋葱表皮蛋白质组学[5]和菠菜叶靶标蛋白研究[6]是已开展的2个与冻融修复相关的典型研究。组织的冻融伤害修复程度通过融化后离子渗出率的减少、光合系统Ⅱ的光合效率恢复、抗氧化酶激活或者活性氧的损耗来评估。组织化学染色表明，在菠菜叶冻融伤害修复期间受伤害组织活性氧的累积或它们被减少的强度同损耗修复一致。

蛋白和基因的丰度直接或间接与膜联蛋白离子平衡相关，受伤害组织的横跨膜水通道蛋白减少，但在融化后修复。修复期间，K+流或离子平衡可能被14-3-3蛋白和膜联蛋白控制，细胞膜中驱动横跨膜K+运输的H+-ATPase是14-3-3对细胞膜整合和激活的主要目标[7]。也就是说，14-3-3蛋白能激活向内的K+通道[8]。通过离子平衡和氧化胁迫的改善，钙磷脂结合蛋白能够促进冻融伤害修复，值得研究。

膜再密封策略在膜冻融伤害修复过程中是可行的。在植物细胞背景下，冻害诱导的囊泡已被用亲脂的荧光染料和共聚焦低温显微镜观察到。Ca2+通过细胞膜上的穿孔点从细胞外间隙流入，最终导致冰冻诱导的囊泡经由Ca2+绑定突触结合蛋白进行融合和细胞膜伤害点的再密封。这表明细胞外Ca2+提高原生质体或未损伤叶细胞的耐冻性和抗电穿孔能力是膜保护而不是膜穿孔的象征[9]。当前，杨树还没有开展冻融伤害后的质膜修复分子机理研究。

3 CBF/DREB调节

在林木抗寒性调控及响应机制方面，发现了CBF/DREB低温信号调节途径及相关转录子。其中，在杨树[10]、蓝桉(Eucalyptusglobulus)[11]、葡萄(Vitisvinifera)[12]等分离鉴定出CBF直系同源基因。CBF/DREB系统诱导抗寒基因表达所编码的防冻蛋白，对保护植物细胞免于低温胁迫伤害很重要。例如，杨树CBF调节因子CBF1、CBF2和CBF3表达诱导物ICEl在冬季休眠芽中上调了391倍，抗寒性增强。

4 转录调控

转录组可定量分析生物受外界环境影响的各基因表达的变化，主要检测的是生物体RNA水平的基因表达量。Chen 等[3]将2年生胡杨分别置于4 ℃和-4 ℃处理6 h后，使用Solexa测序技术对其叶片做转录物组测序。Wang等[13]鉴定了茶树(Camelliasinensis)在自然越冬条件下抗冻锻炼后差异表达基因，包括低温应答基因、质膜稳定基因、渗透应答基因等。上述研究表明，抗冻性强的胡杨关键转录成分主要与ABA及钙信号传导相关，而在抗冻性较弱的茶树中碳水化合物代谢途径和钙信号通路相关基因起主要作用。

小RNAs通过降解mRNA、抑制翻译和修饰染色质诱导转录后基因沉默，在植物胁迫响应过程中发挥着重要作用[14]。Lu等[15]通过构建杨树胁迫处理前后的小RNA文库，成功鉴定19个冷响应miRNAs，其中miR397等低温上调，miR156g-j等低温下调。Chen等[16]也在杨树中鉴定了胁迫响应相关的miRNAs。但目前有关小RNAs调控基因表达及产生抗逆性的具体分子调控机制还不明确，须进一步研究。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指长度大于200个核苷酸、不具备蛋白编码功能的RNA。应用深度测序和生物信息学分析，在拟南芥、水稻、番茄等中鉴定了数千种lncRNAs[17]。在lncRNA响应低温胁迫功能研究方面，模式植物拟南芥取得进展，在其基因组的低温敏感区域鉴定了一个叫SVALKA的lncRNA，SVALKA的突变会影响CBF1基因的表达和植物的冷害抗性[18]。但大多数lncRNA的生物学功能还不清楚。在杨树方面，主要研究了lncRNA在毛白杨木材形成[19]中的作用、lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA网络调节杨树根和茎顶端分生组织的发育[20]、IAA响应的毛白杨lncRNA基因甲基化和生长发育[21]、小叶杨非编码RNA甲基化调节非生物胁迫基因表达[22]。lncRNA调控杨树冻融伤害方面未见报道。

5 CRISPR/Cas9技术

CRISPR/Cas9技术是基于细菌体内的获得性免疫机制改造而成，可通过一条单链的单向导RNA(sgRNA)来识别特定DNA序列，并引导Cas9核酸内切酶剪切DNA双链[23]。该技术已被广泛应用于细菌、酵母和动物的基因组编辑中[24]，而且，李然等利用CRISPR/Cas9技术对番茄lncRNA1459进行了编辑，获得了lncRNA1459的功能缺失突变体[25]。这说明，CRISPR/Cas9技术可以用于lncRNA基因功能研究。

CRISPR/Cas9系统具备同时快速高效地敲除多个内源基因的优势。利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统[26]，在杨树体内同时表达Cas9蛋白和多个针对八氢番茄红素脱氢酶基因的sgRNA，在杨树体内实现了对内源基因的高效定点敲除，获得稳定的基因定点敲除的突变体株系[27]。CRISPR/Cas9系统在杨树功能基因研究和遗传改良中具有广泛的应用前景。

6 DNA修复

DNA修复是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新执行它原来的功能，使细胞能继续生存。如果细胞不具备这种修复功能，就无法应对经常发生的DNA损伤事件，就不能生存，所以研究DNA修复是探索生命的一个重要课题。David R. Liu发明了碱基编辑器，首先借助CRISPRi筛选发现多种促进C-G编辑的因子，在此基础上构建出的新CGBEs的编辑效果有明显提升[28]，使DNA人工修复成为可能。杨树在抗寒性分子机理方面还没有开展DNA修复研究。

7 问题与展望

在杨树基因组测序完成的背景下，杨树抗寒分子机理研究思路从单一基因或蛋白质转向同时对多个基因或蛋白质功能的系统发掘。冻融伤害作为数量性状，受到多基因、多水平的协同调控。研究杨树冻融伤害修复的分子机理是抗寒分子机理研究的发展趋势之一。杨树冻融伤害修复过程中，哪些基因在起作用？其功能是什么? 各个基因之间如何互作？在可逆冻融伤害DNA修复过程中哪些碱基发生了改变和修正？需要系统研究。