渝黔地区细菌发酵型豆豉食用安全性及风味特点比较分析

杨智博，谭小琴，周才琼,2*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)2(重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆，400715)

细菌型豆豉是一种主要利用枯草芽孢杆菌在较高温度下于蒸熟大豆上发酵而成的豆豉，通过其蛋白酶生产出独特的风味[1-2]。我国细菌型豆豉历史久远，主要分布于重庆、贵州、四川、山东和云南等地，传统细菌发酵型豆豉多在冬天生产，一般是将大豆浸泡后蒸至软熟，然后用纱布包裹后置于洗净后控干水分的鸢尾草中(利用鸢尾草作为天然枯草芽孢杆菌源)，置于温暖的火塘边发酵，产生白色丝状物后即发酵完成，然后会根据当地环境条件和食用方式进行相应处理，短期食用的一般拌料后直接食用或加煮豆水直接食用(湿豆豉)，其中添加煮豆水的称“水豆豉”；如需长期食用，则会采用风干或烘干的方式使豆豉脱水至含水量在25%左右(干豆豉)。

目前对于细菌型豆豉的研究报道多集中在豆豉的特性及功能性成分[1,3]和发酵菌株筛选及工艺优化[4-5]等。但目前我国细菌型豆豉的生产多为作坊式并采用传统自然发酵工艺，受环境条件和发酵原材料等因素的影响，豆豉产品品质差异较大，甚至可能会引起一些食品卫生和安全问题[6-10]，包括原辅料安全性问题[11]、微生物安全性问题[12]、化学性及工艺控制[13-15]危害和物理性[16]危害等。传统细菌型豆豉制作过程中发酵菌种多采用带枯草芽孢杆菌的稻草或鸢尾草等为菌源，常会掺杂其他菌种，发酵品质把控多依靠个人的经验，豆豉产品的风味还受产地喜好性影响，风味存在一定的随机性[17-18]，本研究在采集样品过程中就发现部分干型的细菌发酵豆豉样品有特别的臭袜子或汗臭气味。

考虑细菌发酵型豆豉生产方式及发酵完成后不同的处理方式，可能带来食品卫生安全问题。同时风干或烘干过程中会形成臭味，因此有必要对其食品卫生和风味进行深入的研究，以引导安全消费并为后续细菌发酵型豆豉商品化提供相关风味的支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

豆豉样品：以贵州和重庆各地农贸市场为采样点，共采集了17个样品，每个样品2 kg。为方便比较分析，以样品拌料后直接食用或加煮豆水食用者为湿豆豉，以拌料后风干者为干豆豉。样品名称、产地如表1所示。

表1 细菌发酵型豆豉种类及产地Table 1 Types of different bacterial-fermented Douchi samples and their originality

1.2 主要试剂

葡萄糖、DNS、茚三酮、MgO、硼酸、三氯乙酸、乙酸锌、硼砂、对氨基苯磺酸、Na2S2O3、石油醚、甲基红，重庆市钛新化工有限公司；盐酸、三氯甲烷，重庆川东化工(集团)有限公司；AgNO3、酚酞、冰乙酸、可溶性淀粉，成都市科隆化学品有限公司；盐酸萘乙二胺、K2CrO4，上海麦克林生化科技有限公司；硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)、KI，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；K4Fe(CN)6，大连美仑生物技术有限公司；亚甲基蓝，上海源叶生物科技有限公司；以上均为分析纯。亮氨酸，中国食品药品检定研究院。

1.3 主要仪器设备

FA2004A电子天平，上海精天电子仪器有限公司；DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；722型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；ZD-85气浴恒温振荡器，常州朗越仪器制造有限公司；TG16G高速离心机，常州峥嵘仪器有限公司；AQ-180E食品磨粉机，慈溪市耐欧电器有限公司；LGJ-10真空冷冻干燥机，上海风褚实业有限公司；GCMS-QP2010气相色谱质谱联用仪，日本岛津公司。

1.4 实验方法

1.4.1 水分含量测定

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》，采用直接干燥法测定。

1.4.2 理化及微生物指标分析

挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N值)参照GB/T 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》，采用半微量凯氏定氮法测定；亚硝酸盐含量参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中盐酸萘乙二胺法测定；TBA值的测定参照章佳佳等[19]的方法；过氧化值(peroxide value，POV)的测定参照GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》中滴定法；菌落总数按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中倾注法平板计数；乳酸菌按照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》中涂布法平板计数；霉菌和酵母菌参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》涂布平板法计数。

1.4.3 风味特点分析

滋味品质分析：总酸测定采用GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》中酸碱滴定法；总可溶性糖采用DNS比色法[20]，标准曲线(r2=0.999；y=0.673 5x-0.017 7)；游离氨基酸采用茚三酮比色法[21]，标准曲线(r2=0.999；y=0.024 2x-0.000 4)；NaCl测定采用GB 5009.44—2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》中银量法。

挥发性风味分析[22]：采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用法(headspace solid-phase microextraction-mass spectrometry coupled with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)。取5 g粉碎后的样品，放入15 mL固相微萃取样品瓶中，密封。将已经高温净化的固相微萃取针头插入，将萃取纤维头推出暴露到样品瓶顶空中，60 ℃水浴萃取20 min，最后将萃取头插入GC-MS，进样器中解吸。

定性定量分析：将GC-MS中各样品图谱每个峰与NISTlibrary和Wiley library 2个检索库中相关化合物按相似度>800(最大值1 000)进行匹配，按峰面积归一法计算各组分相对含量。

1.5 数据处理

结果以平均值±标准差表示，采用Origin 2019作图，SPSS 20.0进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 渝黔地区细菌发酵型豆豉含水量特点

采集渝黔地区不同产地传统细菌发酵型干豆豉和湿豆豉样品17个，分析其含水量，见表2。含水量分布在16.42%～67.29%，其中湿豆豉平均含水量58.52%(变异系数11.41%)，干豆豉平均含水量23.72%(变异系数26.74%)(表4)，表明干豆豉含水量分布差异更大，从短期食用的高含水量湿豆豉到长期食用的低含水量干豆豉，含水量分布的差异受不同产地食用方式和保藏需要的影响。不同含水量不仅影响豆豉感官品质，也影响其贮藏性能和食用安全性，因此，有必要对市场中传统细菌发酵型豆豉进行食品安全性分析和品质评价以引导合理消费，为细菌发酵型豆豉的商品化开发提供支持。

表2 细菌发酵型湿/干豆豉含水量及菌落总数Table 2 Water content and total viable counts in bacteria-fermented wet/dry Douchi

2.2 细菌发酵型豆豉食品卫生指标分析

2.2.1 微生物群系分析

发酵食品中微生物代谢及胞外酶有促进蛋白质和脂肪降解的作用，但微生物数量控制不当会影响产品品质。对采集各豆豉样品菌落总数进行分析，结果见表2，各样品菌落总数在5.0～8.4 lg CFU/g，与林榕姗[23]报道细菌型豆豉菌落总数在同一水平，表明细菌型豆豉产品在贮藏中菌落总数变化不大。在105～106稀释倍数下未检出酵母菌、霉菌和乳酸菌，原因可能是优势菌芽孢杆菌抑制了其他菌种的生长。进一步对照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行微生物生理生化鉴定，发现各样品中主要为枯草芽孢杆菌，其他有短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌，个别样品检出了汉逊酵母菌、乳杆菌和片球菌，表明豆豉在贮藏中仍处于持续发酵变化中。

2.2.2 脂肪氧化指标TBA值和POV分析

如图1所示，各样品TBA值在1.50～2.89 mg/100 g，干豆豉和湿豆豉TBA均值分别为1.98 mg/100 g(变异系数20.71%)和1.94 mg/100 g(变异系数14.20%)，干豆豉变异系数大于湿豆豉。

图1 细菌型豆豉TBA含量Fig.1 TBA content of bacteria-femented Douchi

如图2所示，各样品POV均符合T/GZSX 014—2018豆豉标准中POV限量值(≤0.25 g/100 g)。湿豆豉和干豆豉POV均值分别为0.004 4 g/100 g(变异系数166.1%)和0.003 4 g/100 g(变异系数75.09%)(表4)，差异较大，表明不同豆豉样品初级氧化产物差异大。这可能与市场不同豆豉样品含水量差异、常温贮藏条件及生产时间有关。

图2 细菌型豆豉POV含量Fig.2 POV content of bacteria-fermented Douchi

2.2.3 TVB-N及亚硝酸盐含量分析

TVB-N是蛋白质分解产生的氨以及胺类等碱性含氮物质，含量越高，表明氨基酸被破坏得越多。如图3所示，各样品TVB-N值在0.58～5.13 mg/g，湿豆豉TVB-N均值3.28 mg/g(变异系数43.96%)，干豆豉TVB-N均值1.72 mg/g(变异系数49.79%)(表4)，有显著差异，与畜肉、蚝油、虾酱的TVB-N上限值(依次分别为15、50、450 mg/100 g)相比处于较高水平[15]。湿豆豉TVB-N均值高于干豆豉，可能与高含水量下微生物活动导致蛋白质分解有关。

图3 细菌型豆豉TVB-N含量Fig.3 TVB-N content of bacteria-fermented Douchi

如图4所示，各样品亚硝酸盐含量在0.6～2.3 mg/kg，湿豆豉和干豆豉亚硝酸盐含量均值分别为1.3 mg/kg(变异系数33.45%)和1.9 mg/kg(变异系数11.66%)，湿豆豉变异系数大于干豆豉。所有样品亚硝酸盐含量均远低于GB 2760—2014食品添加剂使用标准规定的安全标准(≤30 mg/kg)，与GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》非有意添加自然生产的亚硝酸盐(限量3～5 mg/kg)相比，均未超过限值，表明亚硝酸盐含量较低，可安全食用。

图4 细菌型豆豉亚硝酸盐含量Fig.4 Nitrite content of bacteria-fermented Douchi

前述食品卫生分析显示，市场上不同含水量传统细菌型豆豉食品卫生指标差异较大，但均处于安全水平，可安全食用。

2.3 湿豆豉和干豆豉风味特点比较分析

2.3.1 滋味品质特点比较分析

滋味品质成分分析如表3，各样品游离氨基酸、总酸、可溶性总糖和NaCl含量分别在0.17%～7.02%、0.30%～1.95%、1.57%～8.02%和2.95%～11.45%，差异较大。17号样品中游离氨基酸、总酸和可溶性总糖均较高，10号和15号样品总酸含量高；12号样品盐含量最高，分析结果显示不同产地样品具有差异性。

湿豆豉和干豆豉均值及变异系数分析如表4，湿豆豉游离氨基酸、总酸、可溶性总糖含量均值均低于干豆豉，变异系数高于干豆豉；干豆豉食盐含量均值远高于湿豆豉(二者变异系数接近)。这些差异来自大豆发酵、发酵完成后的拌料及豆豉贮藏中持续的发酵过程。表明不同地区豆豉滋味特征除了受发酵本身影响外，还受发酵后处理方式及当地对滋味的喜好有关，如拌料中添加的盐、糖及味精等均影响豆豉的滋味特征。

表3 湿豆豉和干豆豉滋味品质成分分析(可食部)Table 3 Taste and quality components of wet and dry Douchi (edible part)

表4 湿豆豉和干豆豉含水量、卫生指标以及滋味 指标含量均值和变异系数Table 4 Mean values and coefficients of variation of water content, hygienic indexes, and taste indexes in wet and dry Douchi

2.3.2 湿豆豉和干豆豉挥发性风味成分比较分析

豆豉风味与发酵、拌料及拌料后的处理方式有关。考虑含水量、地域等，抽取了干豆豉和湿豆豉各4个样品，分析各样品挥发性风味物质组成(表5)，共检出79种风味物质。8个样品依序分别检出58、55、60、60、56、54、41和45种；1号和3号含量最高的为带有刺激性气味和汗臭味的异戊酸，分别为17.57%和16.36%；6号、10号和15号含量最高的为呈辛辣味的2-甲基丁酸，分别为13.12%、16.83%和17.81%；9号样品带新鲜橙子香的D-柠檬烯(18.68%)含量最高；12号样品含量最高的为有苦味3-甲基戊酸(16.58%)；13号样品中则为呈焙烤香的四甲基吡嗪(45.17%)含量最高。这些特征香气显示不同地域和加工方式的差异及风味的多样性。

表5 渝黔地区细菌型豆豉挥发性风味物质分析Table 5 Relative content of volatile flavor substance of bacteria-fermented Douchi in Chongqing-Guizhou area

续表5

2.3.2.1 挥发性成分种类及含量变化

细菌型豆豉挥发性成分可分为羧酸类、酯类、醇类、吡嗪类、烃类、醚类、酮类和酚类等(图5)，不同来源豆豉均以烃类物质种类最多，酮类和酚类较少。

图5 渝黔地区细菌型豆豉挥发性成分种类的变化Fig.5 Variation of volatile components of bacteria-fermented Douchi in Chongqing-Guizhou area

从相对含量看，湿豆豉1、3、6、9号样品中挥发性风味物质相对含量最高的依次分别是羧酸类(52.28%)、羧酸类(44.78%)、羧酸类+烃类(58.52%)和羧酸类+烃类(50.21%)，干豆豉10、12、13、15号样品相对含量较高的依次分别是羧酸类(52.15%)、羧酸类(50.07%)、吡嗪类(56.88%)和羧酸类(53.95%)(图6)。这可能与干豆豉失水方式有关，烘干时的高温可能会产生具有烘炒香的吡嗪类，高含水的湿豆豉或缓慢风干方式制备的干豆豉则可能持续的发酵产酸等，使羧酸类增加。这些结果显示渝黔地区细菌型豆豉风味特征主要受羧酸类和烃类物质影响。

图6 渝黔地区细菌型豆豉挥发性成分含量的变化Fig.6 Changes of volatile components in bacteria-fermented Douchi in Chongqing-Guizhou area

2.3.2.2 挥发性物质主成分分析

对样品中各类挥发性物质相对含量进行主成分分析，得到各主成分特征值、方差贡献率、累计方差贡献率(表6)，特征根λ1=3.716，λ2=2.852，λ3=1.358，前3个主成分累计方差贡献率达88%，即涵盖了大部分信息。

主成分特征向量与载荷值见表7，第1主成分与醇类高度正相关，与吡嗪类和其他类高度负相关，醇类物质对第1主成分贡献最大；第2主成分与醚类和酚类高度正相关，醚类物质对第2主成分贡献最大；第3主成分与酮类高度正相关，酮类物质对第3主成分贡献最大。主成分分析结果显示醇类、醚类、酮类和酚类也是豆豉风味重要贡献者。

表6 主成分特征根和贡献率Table 6 Principal component characteristic root and contribution rate

表7 主成分的特征向量与载荷Table 7 The eigenvectors and loads of principal components

2.3.2.3 挥发性物质归类和气味贡献值(odor contribution value，OCV)分析

对挥发性气味物质种类按香型特征进行归类(图7)，各样品均具相当的辛辣刺激性气味和甜味感，具有花果香和焙烤香，但13号样品少了能产生出油脂味和苦味的物质，产生果香味的物质种类也较其他样少，且含有由吲哚产生的脚臭味，这可能与其采用失水方法不同有关。

图7 挥发性物质的气味类型Fig.7 Odor types of volatile substances

查阅风味成分气味阈值[24-25]，按公式(1)(2)分别计算气味值(stink valve,SV)和OCV：

(1)

(2)

如表8和图8所示，1、3、6、10、12和15号主要受带苦味的3-甲基戊酸、玉兰香的芳樟醇和/或柠檬香的D-柠檬烯影响，其中1、10、12和15号3-甲基戊酸OCV分别为39.73%、41.83%、40.01%和49.71%，苦味明显；9号最高的是D-柠檬烯和芳樟醇(OCV合计43.17%)，带柠檬和玉兰香气；13号样品中SV最高的是2,3,5-三甲基吡嗪，其次是D-柠檬烯，焙烤香中带有柠檬味。这表明不同来源及不同处理豆豉风味的巨大差异，包括持续发酵产生的苦味肽、干制温度的影响及拌料中添加的姜米和橘皮带来的风味等均参与了传统细菌发酵豆豉风味的形成。

图8 渝黔地区细菌型豆豉气味贡献值Fig.8 Odor contribution value of bacteria-fermented Douchi in Chongqing-Guizhou area

细菌发酵型豆豉，特别是经过风干或烘干的干豆豉，多带有程度不同的汗臭或脚臭气味，而成为1种地方性臭味美食，对于没有消费习惯的人群较难接受。本研究发现各样品均含具有脚臭和汗臭味的异戊酸，SV在0.796～32.537，OCV在0.04%～1.57%，均以13号最低，这可能与豆豉发酵后13号样品采用的烘干方式有关。湿豆豉中不含或仅含少量吲哚，可赋予豆豉茉莉或孜然风味，随着干制中含水量下降，吲哚含量升高，13号样品中吲哚的SV和OCV分别达24.286和1.24%，使干制豆豉散发特有气味。因此，豆豉发酵完成拌料后湿豆豉如何控制贮藏条件、干豆豉的干制方式及含水量控制都影响豆豉的风味，传统细菌型豆豉的商品化还需要从贮藏和干制条件等做更多的研究。

表8 渝黔地区细菌型豆豉气味值及其风味描述Table 8 Odor value and flavor description of bacteria-fermented Douchi in Chongqing-Guizhou area

3 结论

水分含量是食用品质的重要组成部分。经检测分析渝黔地区17个细菌型豆豉样品，结果显示湿豆豉和干豆豉平均含水量分别为58.52%和23.72%，干豆豉含水量分布差异更大。

食品卫生指标分析显示，湿豆豉和干豆豉TBA均值含量差异不大；POV差异较大，但均符合T/GZSX 014—2018标准限量(≤0.25 g/100 g)；湿豆豉和干豆豉的TVB-N值与畜肉、耗油等食品限量相比，处于较高水平，湿豆豉均值大于干豆豉；亚硝酸盐含量远低于GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定的安全标准(≤30 mg/kg)，也低于GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》非有意添加自然生产的亚硝酸盐(限量3～5 mg/kg)限值。微生物分析显示，各样品菌落总数在5.0～8.4 lg CFU/g范围内，在105～106稀释倍数下未检出酵母菌、霉菌和乳酸菌，进一步对照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行微生物生理生化鉴定，个别样品检出了汉逊酵母菌、乳杆菌和片球菌，表明豆豉在贮藏中仍处于持续发酵变化中。这些结果表明传统细菌发酵型豆豉可安全食用。

滋味品质分析显示，不同来源及不同含水量豆豉的酸、鲜、甜和咸的味感差异大，湿豆豉游离氨基酸、总酸和可溶性总糖含量均值低于干豆豉，变异系数高于干豆豉，干豆豉食盐含量均值远高于湿豆豉，这些差异来自大豆发酵、发酵完成后的拌料及豆豉贮藏中持续的发酵过程。挥发性风味成分分析显示羧酸类、烃类、酯类和醇类是影响传统细菌型豆豉主要的风味成分，且样品均含具有汗臭或脚臭味的异戊酸，构成了细菌型豆豉特征风味，但13号样品中主要为呈焙烤香的四甲基吡嗪，这可能与其干燥方式有关，该样品还含较高的吲哚。其他样品主要为羧酸类和烃类。不同地区在豆豉发酵完成后，由于对风味的喜好以及食用方式不同，采用的处理方式不同，从而导致风味产生差异。

本研究可为后续渝黔地区细菌发酵型豆豉合理贮藏、控制干制方式等提供理论依据，以提升豆豉的风味，并为细菌发酵型豆豉的商品化提供支持。

致谢：感谢西南大学食品科学学院实验教学中心张玉老师为本研究提供GC-MS检测服务。