芪蛭通脉颗粒对冠状动脉粥样硬化模型大鼠的干预作用机制研究※

宋欠红 樊 睿 李 易 李戈媛 叶 勇 赵 淳

(云南中医药大学第一附属医院心血管病科，云南 昆明 650021)

动脉粥样硬化是心脑血管疾病的重要病理变化之一，可随着年龄增长而加重[1]。动脉粥样硬化是多种因素引起的慢性、弥漫性、渐进性炎症病变，是血管壁对多种损伤的异常反应，具有变性、增殖的典型炎症特点[2-3]。芪蛭通脉颗粒是我们根据益气活血通络法结合云南民族医药创制的治疗冠心病的经验方，前期研究表明芪蛭通脉颗粒对冠心病胸闷、胸痛、气短及血脂异常均有很好疗效[4-5]。为进一步研究芪蛭通脉颗粒治疗冠心病的作用机制，本研究通过观察芪蛭通脉颗粒对冠状动脉粥样硬化大鼠冠状动脉组织Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)蛋白表达及血清白细胞介素6(IL-6)、IL-8、IL-10水平的影响[6-8]，探讨芪蛭通脉颗粒治疗冠心病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量240～280 g，自由饮水进食，饲养温度(20±2)℃，湿度25%～60%，由昆明医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(滇)2018-0003，大鼠合格证号：430067000011726。

1.2 实验药物 芪蛭通脉颗粒(药物组成：炙黄芪20 g,水蛭粉3 g,红曲6 g，灯盏细辛15 g，三七6 g，均采用中药颗粒剂，四川新绿色药业科技发展有限公司提供)；阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司，国药准字H20051408)；垂体后叶素注射液(上海禾丰制药有限公司，国药准字H31022751)。

1.3 主要实验试剂与仪器 IL-6、IL-8及IL-10酶联免疫吸附(ELISA)测定试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)；TLR4及NF-κB蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；兔源TLR4/NF-κB抗体(美国Cell signaling technology公司)；电子分析天平(德国Sartorius公司)；凝胶成像设备(美国BIO-RAD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 造模与分组 所有大鼠适应性饲养1周后，随机分为空白对照组、模型组、阿托伐他汀钙组及芪蛭通脉低、中、高剂量组，每组10只。参照相关文献[9-10]制作大鼠冠状动脉粥样硬化模型。除空白对照组外，其余各组均给予高脂饲料(87.3%基础饲料，2%胆固醇，10%猪油，0.5%胆酸钠，0.2%丙基硫氧嘧啶)喂养8周(56 d)，按5 g/kg灌胃，每日1次，空白对照组给予5 mL/kg蒸馏水灌胃。其中从第53 d开始，模型组、阿托伐他汀钙组及芪蛭通脉低、中、高剂量组给予垂体后叶素注射液3 U/(kg·d)腹腔注射，连续给药3 d。第3次注射完毕后30 min内进行心电图检测，若肢体导联ST段抬高超过0.1 mV，或有T波高耸，则视为造模成功[11]。

1.4.2 给药方法 于第9周开始药物干预，实验动物与成人用药量的换算方法：人用量×0.0026×50=大鼠用量/kg体质量[12]。芪蛭通脉低、中、高剂量组分别按6.5、13、26 g/(kg·d)给予芪蛭通脉水溶液灌胃，阿托伐他汀钙组按13 mg/(kg·d)给予阿托伐他汀钙水溶液灌胃，空白对照组按5 mL/kg给予蒸馏水灌胃。各组均连续灌胃4周。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 血液指标 各组均连续灌胃4周后，予以腹腔内注入10%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉，然后将大鼠四肢、头部固定，仰卧位，0.22%碘伏消毒皮肤，切开腹壁组织，暴露腹主动脉，在腹主动脉处采动脉血5 mL，1 500 r/min离心15 min后，取上清液置于-20 ℃冰箱保存备用。采用ELISA法检测血清IL-6、IL-8及IL-10水平，严格按照操作说明书进行。

1.5.2 心肌组织指标 各组大鼠抽血完毕后，打开胸腔，充分暴露并取下心脏，采用Western blot法检测心肌组织TLR4及NF-κB蛋白相对表达情况[13-14]。摘取前降支、回旋支、右冠状动脉等冠状动脉组织，每只大鼠取3 mm×3 mm，用眼科剪剪碎，放置于10 mL离心管中，加入裂解液，匀浆器充分匀浆，使其充分裂解，转移至1.5 mL EP管中，4 ℃，1200 r/min离心15 min，取上清液，保存于-80 ℃环境中。然后按照Western blot法操作说明书进行，以GAPDH内参，得出待测蛋白的条带后，用凝胶成像分析系统扫描蛋白条带后进行光密度分析，计算相对表达量。

2 结果

2.1 造模情况 造模后，各组大鼠活动减少，饮水减少，毛色光泽度下降，其中模型组大鼠死亡2例，芪蛭通脉中剂量组大鼠死亡1例，其余大鼠均造模成功。

2.2 各组大鼠灌胃后血清IL-6、IL-8、IL-10水平比较 与空白对照组比较，模型组血清IL-6、IL-8水平均升高(P<0.05)，IL-10水平降低(P<0.05)。与模型组比较，芪蛭通脉中、高剂量组血清IL-6、IL-8水平均降低(P<0.05)，芪蛭通脉高剂量组IL-10水平升高(P<0.05)，阿托伐他汀钙组、芪蛭通脉低剂量组IL-6、IL-8、IL-10水平及芪蛭通脉中剂量组IL-10水平与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。芪蛭通脉3个剂量组组间比较，芪蛭通脉高剂量组血清IL-6、IL-8水平均低于芪蛭通脉低剂量组(P<0.05)、IL-10水平高于芪蛭通脉低剂量组(P<0.05)，IL-8水平低于芪蛭通脉中剂量组(P<0.05)，芪蛭通脉中剂量组IL-6、IL-8水平均低于芪蛭通脉低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠灌胃后血清IL-6、IL-8、IL-10水平比较

2.3 各组大鼠冠状动脉组织TLR4、NF-κB蛋白相对表达比较 与空白对照组比较，模型组冠状动脉组织TLR4、NF-κB相对表达升高(P<0.05)。与模型组比较，芪蛭通脉低、中、高剂量组冠状动脉组织TLR4、NF-κB相对表达均降低(P<0.05)，阿托伐他汀钙组仅NF-κB相对表达降低(P<0.05)，阿托伐他汀钙组TLR4相对表达与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。芪蛭通脉3个剂量组组间比较，芪蛭通脉低、中、高剂量组冠状动脉组织TLR4、NF-κB相对表达组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2、图1。

表2 各组大鼠冠状动脉组织TLR4、NF-κB蛋白相对表达比较

注：A空白对照组；B模型组；C阿托伐他汀钙组；D芪蛭通脉低剂量组；E芪蛭通脉中剂量组；F芪蛭通脉高剂量组图1 各组大鼠冠状动脉组织TLR4、NF-κB蛋白相对表达情况

3 讨论

动脉粥样硬化是冠心病发生的独立危险因素，其特点是动脉管壁增厚、变硬，失去弹性和管腔缩小，由于在动脉内膜上积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。随着社会经济水平的发展，人们饮食结构发生了变化，高油、高盐、高糖饮食，运动量不足，工作压力大，使动脉粥样硬化发病率逐年增加。TLR4/NF-κB是人和大鼠动脉粥样硬化过程中重要的信号通路。NF-κB是TLR下游的重要因子，参与动脉粥样硬化的各个阶段，能够反映动脉粥样硬化的进程，在其形成过程中发挥重要的作用[15]。研究表明，斑块不稳定和斑块破裂可使TLR4/NF-κB信号通路高表达[16]。IL-6是人体重要的促炎因子，主要由单核-巨噬细胞、血管内皮细胞、T淋巴细胞等合成分泌，在血液中广泛存在，IL-6与受体结合后，可诱导多种细胞分化、成熟和凋亡，是动脉粥样硬化及血管炎性反应过程中的独立危险因素[17]。IL-8作为典型的炎症趋化因子，在动脉粥样硬化发生发展过程中具有重要作用，其可能作用机制包括:①促进单核细胞与内皮细胞黏附，促进平滑肌细胞增殖和迁移，参与早期动脉粥样硬化斑块的形成；②诱导中性粒细胞到达已受损的血管内皮，启动凝血系统的级联反应，促使斑块破裂出血[18-19]。IL-10是重要的抗炎因子，可以减少细胞凋亡，抑制巨噬细胞活化，也抑制活化基质金属蛋白酶(MMPS)和炎症因子生成，在抑制促炎细胞因子产生的同时增加自身表达，下调黏附分子表达，减少脂质堆积[20]。

冠心病属中医学胸痹、胸痛等范畴，瘀血阻络是其发生的主要病因病机。平素嗜食膏粱厚味，损伤脾胃，助湿生热，热耗津液，导致心脾气虚，运化失常，转化为痰浊脂液，导致气血受阻，气机运行不畅，气结血凝，瘀血阻络，心脉痹阻，而发生胸痛。芪蛭通脉颗粒正是根据瘀血阻络的病因病机拟定的治疗冠心病的经验方，方中黄芪补气升阳，行滞通痹，为君药；水蛭破血通泄，逐瘀力强,三七活血化瘀而不伤正，两者共为臣药；红曲健脾化痰，为佐药；灯盏细辛活血通络止痛，为使药。全方共奏益气活血、化瘀通络之效。现代药理研究亦表明，黄芪可提高免疫力，改善心功能，并有抗衰老作用[21]；水蛭有较强抗凝血作用[22]；三七主要含有人参皂苷和三七皂苷，具有降低心肌耗氧量、改善心肌氧利用率、抗动脉粥样硬化等作用[23]；红曲可加速胆固醇代谢，保护血管内皮，改善内皮功能[24]；灯盏细辛为云南民族药，可以改善血液流动，具有保护血管内皮作用[25]。

本实验研究结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-8水平均升高(P<0.05)，IL-10水平降低(P<0.05)，冠状动脉组织TLR4、NF-κB相对表达升高(P<0.05)，提示模型组在冠状动脉粥样硬化进程中出现明显的炎性反应，TLR4/NF-κB信号通路被激活，TLR4、NF-κB蛋白表达明显升高。与模型组比较，芪蛭通脉中、高剂量组血清IL-6、IL-8水平均降低(P<0.05)，芪蛭通脉高剂量组IL-10水平升高(P<0.05)，芪蛭通脉低、中、高剂量组冠状动脉组织TLR4、NF-κB相对表达均降低(P<0.05)，阿托伐他汀钙组仅NF-κB相对表达降低(P<0.05)，其中芪蛭通脉高剂量组对血清IL-6、IL-8水平改善均优于芪蛭通脉低、中剂量组(P<0.05)。提示经相应灌胃治疗后各组大鼠的炎性反应和TLR4/NF-κB信号通路激活情况均有一定抑制，其中芪蛭通脉高剂量组的治疗效果更佳。

综上所述，芪蛭通脉颗粒对冠状动脉粥样硬化大鼠治疗作用确切，其作用机制可能与调控TLR4/NF-κB信号通路，抑制炎性反应有关，但其有效剂量及明确的量效关系有待进一步深入研究。