胎盘血管生成异常致复发性自然流产及其中医药治疗的研究进展*

姚伟洁，冯 欣

首都医科大学附属北京妇产医院北京妇幼保健院，北京 100006

复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是妊娠的常见并发症之一，我国通常将妊娠28周前3次及以上胎儿丢失称为RSA，其发生率为15%～25%，且复发风险随流产次数的增加而上升。RSA的病因复杂，妊娠12周以前RSA的病因多为遗传因素、内分泌异常、生殖免疫功能紊乱及血栓前状态等，12周至28周出现RSA主要为血栓前状态、感染、妊娠附属物异常和严重的先天性异常等［1］。目前针对RSA的治疗主要通过手术纠正子宫解剖结构异常，通过叶酸、肝素及阿司匹林等药物改善母体高凝状态，或通过诱导产生封闭抗体从而抑制母婴间的免疫排斥。

有研究发现，滋养层细胞功能缺陷导致的血管生成异常被认为是RSA最重要的原因之一，通过调节滋养层细胞增殖、迁移和侵袭来促进胎盘血管生成，可以作为治疗RSA有效方法之一［2］。血管生成因子和微小核糖核酸（Micro RNA， miRNA）是影响血管生成的关键因素。此外有研究发现，外泌体具有重要的血管生成调控作用［3］，外泌体能够将信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）、miRNA和蛋白质等物质传递给受体细胞，进行细胞间的通讯，从而改善血管生成以维持正常妊娠。

中药治疗RSA具有独特优势，而且取得了较好疗效，其现代研究也发现中药复方能通过调控血管生成而对RSA发挥治疗作用。本文对影响RSA胎盘血管生成的血管生成因子、miRNA以及外泌体在血管生成中的调控作用进行综述，并阐述中药复方通过调控血管生成治疗RSA的现状，为中药复方治疗RSA提供新思路。

1 血管生成异常参与了多种疾病的发生

血管生成异常导致了多种疾病的发生发展。血管内皮细胞通过增殖、迁移，形成新的血管，并进行血管网络的重建，从而为器官提供血液和氧气，是器官生长和发育的重要途径。该过程由多种生长因子和信号传导途径控制，且依赖于促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡调控，当该平衡被打破，则诱发疾病。血管生成不足会引发高血压、动脉粥样硬化以及心肌缺血等心血管疾病。血管生成过量，则会诱发肿瘤疾病［4］。ZANG等［5］发现木犀草素能够通过抑制Notch1表达抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌，进而抑制胃癌细胞的血管生成而形成血管生成拟态。HANG等［6］提出姜黄素能够抑制胃癌细胞来源的间充质干细胞诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）成管、迁移和集落形成，并与VEGF有关。IWASAKI等［7］使用胎盘生长因子（placental growth factor，PlGF）疗法，通过促进心肌修复和血管生成治疗缺血性心脏病，取得了良好效果。以上研究结果表明改善血管生成已成为治疗血管生成失衡疾病的重要手段。

2 RSA与血管生成

研究发现，血管生成参与了妊娠全过程，妊娠成功取决于胎盘能否构建良好的血管网络以满足母体与胎儿之间的生理交换［8］。血管生成伴随着子宫和脐带血流量的显著增加，从而为胎儿提供充足的血液和氧气，有利于胚胎着床与发育。特别在孕晚期，子宫和脐带的血流量及血管密度随着胎儿生长而急剧增加［9］，若血管生成异常，胚胎血供减少，营养供给不足，胚胎无法存活，从而导致流产［10］。王为男等［11］通过免疫组化染色法发现，RSA患者绒毛间质内血管数量明显减少，管腔狭窄，甚至出现血管破裂和血细胞外溢等现象。Abdel-Razik等［12］采用三维多普勒超声观察发现RSA患者子宫动脉血流阻力较高，且子宫内膜血流较低。更有学者以同样方法证实RSA患者子宫内膜血管化程度较正常妊娠女性降低，并提示螺旋动脉数量不足，显示患者血管生成与血流灌注受损［13］。以上研究均证明血管生成异常是RSA患者的显著病理特征，而血管生成的正常进行是成功妊娠的必要前提。因此，改善血管生成成为治疗RSA的有效方法之一。

3 血管生成因子和miRNA RSA对胎盘血管生成的影响

3.1 血管生成因子在调控RSA胎盘血管生成中发挥重要作用多个促血管生成因子和抗血管生成因子参与了血管生成过程，如VEGF、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、血管生成素（Angiopoietin， ANG）蛋白家族和金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）等。血管生成因子通过促进或抑制血管生成诱导疾病发生。可见，调控血管生成因子可以成为治疗血管生成异常的方式。

3.1.1 VEGF VEGF对血管生成发挥重要的促进作用是参与血管生成过程中的关键蛋白［5，14-15］，有研究发现在妊娠过程中胎儿和胎盘组织中均能检测到VEGF蛋白及其mRNA表达，VEGF通过介导子宫内膜组织血管重塑，利于胚胎着床，是重要的生长调节因子［16］。而通过检测RSA患者血清发现其VEGF含量较正常妊娠女性显著降低［17］。XU等［18］通过Meta分析发现，VEGF基因1154G/A（rs1570360）、+936C/T（rs3025039）、634G/C（rs2010963）和583T/C（rs3025020）多态性与RSA易感性有关。

VEGF主要通过调控VEGFR-1和VEGFR-2酪氨酸受体发挥生物学效应。有研究发现，敲除VEGFR-1会导致胎盘血管生成障碍，从而导致流产［9］。sVEGFR-1为VEGF的可溶性受体，又称为可溶性fms样酪氨酸激酶（soluble FMS-related tyrosine kinase 1，sFLT-1），它可以与VEGF的膜受体竞争结合VEGF，从而抑制VEGF诱导血管生成的生物学活性，是VEGF的有效拮抗剂［19］。VEGF通过与VEGFR-2结合，促使VEGFR-2发生二聚化和自磷酸化而激活，进而对下游信号通路发挥激活作用，促进血管生成［20-21］。除了在胎盘血管生成中的作用外，VEGF还参与胎盘血流量调节。BOGIC等［22］通过超微结构观察和荧光染色发现，VEGF存在于羊胎盘的母体和胎儿血管中，且VEGF在妊娠期间可改善膜内血管的分布和通透性。

3.1.2 FGFs FGFs在体内和体外均是有效的血管生成因子。FGF可刺激子宫动脉和胎儿胎盘动脉内皮细胞增殖，促进血管生成，提高多种细胞类型的细胞存活率［23］。唐雪莲等［24］通过12例人早孕绒毛离体组织及16例RSA绒毛体外分离培养，消化分离出细胞后，加入FGF进行培养，发现FGF能够促进绒毛滋养层细胞生长。

3.1.3 ANG蛋白家族 ANG蛋白家族也被证明是重要的血管生成因子，对血管生成具有调节作用，包括ANG1、ANG2、ANG3、ANG4和酪氨酸激酶受体1和2（Tie1和Tie2）。ANG蛋白家族均可与Tie结合发挥对血管生成的调节作用，其中ANG1和ANG4能够通过诱导Tie2的磷酸化促进血管生成，ANG2和ANG3能够抑制Tie2的磷酸化，从而抑制血管生成［25］。Hess等［26］通过检测孕鼠模型ANG1含量发现其ANG1 mRNA表达升高。而LEINONEN等［27］发现，ANG1或Tie2的缺失可导致孕鼠血管生成障碍，进而造成不良妊娠结局。杨廷仙［28］通过测定流产患者血清和蜕膜组织ANG1和ANG2发现二者能够通过影响血管生成造成流产。

3.1.4 EMMPRIN EMMPRIN在胎盘中同样被证明具有促血管生成作用。DANG等［29］通过比较未孕、孕中期和孕后期的大鼠发现，EMMPRIN有助于上调子宫和血管中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达，促进胎盘发育早期的螺旋动脉重塑过程。王永清等［30］发现，孕妇绒毛组织中存在EMMPRIN阳性表达，绒毛内滋养层细胞中的EMMPRIN表达随孕周增加而逐渐加强，通过RNA干扰EMMPRIN的表达能够抑制滋养细胞侵袭。

3.2 RSA的发生存在miRNA表达差异，并与胎盘血管生成密切相关

3.2.1 RSA的发生存在miRNA表达差异 miRNA是约22个核苷酸的非编码RNA分子，参与转录后的基因调控。有证据表明，miRNA在子宫内膜异位症、先兆子痫、不育症和其他生殖系统疾病中起重要作用。DONG等［31］使用人类miRNA芯片分析了RSA患者与正常妊娠妇女的绒毛或蜕膜中miRNA表达谱，发现RSA患者绒毛中hsa-miR-184、hsa-miR-187和hsa-miR-125b-2的表达较高，而hsa-miR-520f、hsa-miR-3175和hsa-miR-4672的表达低于正常妊娠妇女。且在RSA患者蜕膜中发现hsa-miR-517c、hsa-miR-519a-1、hsa-miR-522、hsa-miR-520h和hsa-miR-184表达上调。通过对差异miRNA进行Gene Ontology（GO）分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析发现，RSA的发生与miRNA血管生成有关。以上研究表明RSA的发生存在miRNA表达变化，探寻差异miRNA的表达可以作为诊断RSA的标记物，也可为治疗RSA提供可能。

3.2.2 miRNA通过影响胎盘血管生成导致RSA miRNA在RSA的血管生成中发挥了重要作用，ZHU等［32］通过测定RSA患者绒毛和蜕膜组织发现miR-16表达升高，体外实验中miR-16的上调抑制了HUVECs增殖、迁移和血管形成。进一步通过注射miR-16到小鼠体内，发现异常的miR-16水平会影响微血管密度及胎盘和胚胎重量，并通过抑制VEGF在怀孕小鼠中的表达而引起RSA。XIA等［33］通过分离流产患者胚胎绒毛组织样本，证明miR-575在流产孕妇的胎盘中被显著上调。进一步通过体外培养人绒毛膜癌细胞JEG-3，并使用miR-575抑制剂进行干预，发现血管生成蛋白VEGF表达显著升高，并有效促进了血管生成。以上研究表明miRNA的变化可通过抑制胎盘血管生成进而导致RSA。

4 外泌体参与了胎盘血管生成，在临床治疗RSA中具有应用前景

研究表明，血管生成可以被细胞来源的外泌体调节。外泌体是杯状磷脂双层囊泡，大小在40～100 nM之间，外泌体的产生源于细胞膜向内出芽并形成核内体，后期核内体限制膜向多泡体（multivesicular bodies，MVBs）内侵，MVBs与质膜融合释放出内囊泡，即为外泌体［3］。外泌体已经被证明可以从多种类型细胞中释放，其包含基于起源组织的蛋白质、mRNA和miRNA，其通过与受体细胞结合进行细胞间的通讯并影响受体细胞功能［3，34］。

研究发现，从RSA患者子宫冲洗液和黏液中能够分离得到外泌体，表明外泌体存在于子宫内膜上皮细胞的顶端表面上。通过对子宫内膜上皮细胞及其分泌的外泌体进行miRNA分析，发现hsa-miR-200c、hsa-miR-17和hsa-miR-106a含量最高，且与胚胎植入高度相关［35］。GIACOMINI［36］通过分离人胚胎源外泌体发现其能够被子宫内膜细胞吸收，表明胚胎和子宫内膜能够通过外泌体进行信息通讯。Komaki则通过培养人足月胎盘组织中的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），并分离培养基中MSCs分泌的外泌体，发现MSCs分泌的外泌体能够刺激内皮细胞血管生成，表明胎盘中释放的外泌体具有血管生成的调节作用。

外泌体能够通过携带蛋白和miRNA至靶细胞，进而调节血管生成。VRIJSEN等［37］通过分离心肌细胞祖细胞中的外泌体，发现其对内皮细胞迁移具有促进作用，进一步分离外泌体得到EMMPRIN，发现EMMPRIN能够通过诱导MMP和VEGF表达促进细胞迁移和血管生成。该实验为临床治疗RSA提供了新思路。通过分离RSA患者血清及蜕膜组织，并提取其中的外泌体，通过测定外泌体中差异蛋白及miRNA表达，可以快速确定RSA发生的影响因素。甚至通过改造外泌体，使其包裹具有改善血管生成的蛋白或miRNA，从而达到治疗RSA的目的。

5 中医治疗RSA的现状

5.1 中医对RSA病机的认识中医认为RSA属“滑胎”“数堕胎”及“屡孕屡堕”等范畴，其最早见于隋代《诸病源候论·妇人妊娠诸侯上》，而宋代齐仲甫在《女科百问》一书中首次提出了其临床特点为“应期而下”，并指出可以通过预服杜仲丸（由杜仲、续断组成）预防滑胎，开创了补肾法治疗滑胎的先河［38］。通过对医家治疗RSA的总结，普遍认为滑胎主要源于肾虚导致的冲任虚寒，进而引起胎失所养，胎结不实，屡孕屡堕。肾虚失煦或阴虚生热会导致血瘀，新血下注胞宫不利，胎失所养，进而导致胎动不安或堕胎［39-40］。因此治疗RSA的治则可概括为“温肾补脾，活血化瘀”，从而达到安胎的治疗效果。

5.2 中药复方能够通过改善血管生成治疗RSA滋肾育胎丸是罗元恺教授在“寿胎丸”的基础上加减而成，可用于治疗脾肾两虚、冲任不固所致的胎动不安及滑胎等，其治疗RSA的有效率达90%以上。其功效为补肾健脾、益气培元、养血安胎、强壮身体。储继军等［41］使用CBA/J×DBA/2小鼠构建RSA动物模型，通过滋肾育胎丸治疗，发现其能够降低RSA小鼠的胚胎丢失率，通过提高RSA小鼠体内VEGF、VEGFR-2表达改善蜕膜血管新生与重铸。进一步研究发现，滋肾育胎丸能够改善VEGF/PI3K/AKT信号通路，改善蜕膜组织的微血管密度［42］。

补肾安胎冲剂是安徽中医药大学第一附属医院的院内制剂，其在“寿胎丸”的基础上加减，并根据“肾主生殖”“胞胎系于肾”理论形成，可补肾健脾，益气安胎。研究发现，其治疗妊娠成功率达80%以上，经补肾安胎冲剂治疗的RSA患者，其血清VEGF水平升高，sFlt-1水平降低，并与促进胎盘绒毛血管形成显著相关［43］。进一步研究通过DBA/2×CBA/J小鼠构建RSA动物模型，并经过补肾安胎冲剂干预，光镜及电镜下观察到蜕膜组织血管数量与RSA组相比更加丰富，血管壁及血管内皮细胞结构趋于完整［44］。储继军等［32］还发现补肾安胎冲剂能通过升高RSA小鼠蜕膜组织中的VEGF及VEGFR-2表达，从而改善蜕膜组织的血管重铸［45］。而李伟莉等［46］研究发现补肾安胎冲剂可以通过上调RSA小鼠蜕膜组织中TGF-β1/PI3K/Akt信号通路，进而促进RSA小鼠母胎界面血管生成。郝乐乐［47］研究发现补肾安胎冲剂可通过激活VHL/HIF-1α信号通路从而间接启动VEGF通路，促进血管生成。

养血安胎方是首都医科大学附属北京妇产医院李恩堂先生的经验方，目前已在临床应用30余年，其保胎成功率达98.2%，获子率为98.0%［48］，可补肾健脾，养血安胎。武颖等［49-50］通过建立肾虚血瘀型复发性流产小鼠模型对该方进行了更深入研究，并使用养血安胎方进行干预，发现该方能够通过调控TGF-β/Smad通路促进子宫内膜VEGF表达，从而调节胎盘植入，且疗效与剂量成正相关。

此外，党慧敏等［51］研究发现补肾活血方联合地屈孕酮片能够明显上调RSA患者血清中VEGF表达水平，从而促进胎盘血管生成以维持妊娠。冯延红等［52］通过安胎止血方联合西药治疗RSA患者，发现患者血清中胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）、Ang-2水平均较治疗前升高，从而促进血管生成，提高妊娠成功率。杨秀芳等［53］研究发现补肾益气养血方联合西药治疗RSA，有助于升高患者PLGF和Ang-2水平，提高妊娠成功率。

6 总结

越来越多的证据显示，RSA的发生与血管生成障碍有关，血管生成因子和miRNA作为影响血管生成的关键因素，越来越受到研究者的重视。血管生成因子具有促进或抑制血管生成的作用，从而影响疾病的发生发展。通过激动促血管生成因子表达，可以促进血管生成，进而改善RSA。miRNA作为近年的研究热点，其血管生成调节作用在多种疾病中都得到了验证，在RSA患者中，miRNA可通过调节血管生成相关因子抑制血管生成，导致RSA的发生。而外泌体作为胎盘与母体间进行交流的通讯形式，能够通过携带蛋白质、mRNA和miRNA至受体细胞，进而影响受体细胞的功能。通过分离RSA患者的血清及蜕膜组织中的外泌体，并测定外泌体中差异蛋白及miRNA的表达，可以快速确定影响RSA发生的蛋白及miRNA。而通过改造外泌体，使其包裹具有改善血管生成的蛋白或miRNA，也可作为治疗RSA的有效方法之一。

中药复方治疗RSA一般以补肾活血为治则，现代研究发现中药复方治疗RSA多通过调节血管生成因子来促进血管生成，从而改善妊娠成功率。然而，由于复方成分复杂，中药的治疗作用往往是多靶点的，至今尚未发现中药复方通过调节外泌体，进而调节外泌体中的蛋白及miRNA的相关报道，因此，该领域具有重大研究前景。