雷敏 胡丽丽 艾明
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常见的眼部并发症,已成为全球主要的致盲原因之一[1]。DR按疾病进程分为非增殖性DR(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)和增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy,PDR)两个阶段[2]。2021年国际糖尿病联合会糖尿病流行病学报告指出,近50多年来全球糖尿病的患病率呈持续上升趋势,预计到2030年将上升至10.2%[3]。《中国老年糖尿病诊疗指南》(2021年版)指出,2019年中国65岁以上糖尿病患者数约3 550万,居世界首位,占全球老年糖尿病患者的1/4[4]。研究显示,视网膜屏障的破坏、视网膜新生血管形成及视网膜神经退行性病变在DR进展中发挥着重要作用,其发病机制涉及多种调控机制和通路[5]。近年来,临床针对DR的治疗主要有抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)药物和皮质类固醇药物的玻璃体腔内注射、视网膜激光光凝和后入路玻璃体切除手术[6],但仍然存在部分患者治疗效果不佳及视力预后不理想的情况。研究已证实,在DR发展早期,促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)具有明显的血管神经保护作用[7],PDR患者血清中EPO水平明显升高,且EPO水平与PDR临床分期呈正相关[8-9]。本文就EPO相关通路在DR中的发病作用机制研究进展作一综述。
EPO是一种由4个α螺旋束组成的糖基化细胞因子,属于集落刺激因子。胚胎期由胎儿肝脏产生,出生后主要由肾脏产生[10]。EPO在人体组织中广泛分布,对心脏、胃肠道、肌肉、肾脏、胰腺和神经组织等有直接影响,可靶向作用红细胞、类红细胞及其祖细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、内皮细胞和骨髓基质细胞等[11]。EPO是一把双刃剑,近年来研究发现,生理状态下EPO对视网膜神经元、微血管内皮细胞、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞和Mller细胞具有保护功能[12]。EPO通过与EPO受体(erythropoietin receptor,EPOR)的相互结合发挥作用,有研究表明EPOR在PDR患者玻璃体中的表达水平越高预后越差,故EPOR有望作为PDR的预后生物标志物和潜在的治疗靶点[13-14]。
研究发现EPO既参与视网膜的生理性血管生成,又参与病理性血管生成[11]。研究已证实,在DR发展早期,EPO具有明显的血管神经保护作用[7]。Wang等[15]发现,EPO通过抑制甲基乙二醛的形成来降低血管生成素2(angiogenin-2,Ang-2)的表达,从而减少视网膜周细胞的丝氨酸-苏氨酸激酶磷酸化,进而抑制周细胞迁移和凋亡,预防DR早期微血管损伤,在DR早期发挥保护作用。Gu等[16]发现EPO主要通过维持谷氨酸-谷氨酰胺循环相关蛋白的正常表达,抑制高糖条件下凋亡诱导因子易位和聚腺苷-核糖聚合物形成,下调谷氨酸受体,抑制视网膜神经元过度兴奋和神经元毒性,减少神经元细胞死亡,来实现其神经保护作用。Bretz等[17]发现EPOR基因敲除小鼠视网膜的内层和外层网状层更薄,异位神经突起和b波更低,进一步证实了EPO的血管神经保护作用。另外研究显示,生理状态下玻璃体中EPO水平是血浆中的3.5倍,DR患者玻璃体EPO水平比血浆高30倍,比非糖尿病患者玻璃体内EPO高10倍[18]。PDR患者血清中EPO水平明显升高,且EPO水平与PDR临床分期呈正相关[8-9]。有学者提出,EPO具有类似于VEGF的促血管形成活性,能够刺激内皮细胞增殖、迁移和血管生成[19-20]。进一步证实,PDR患者玻璃体中EPO与VEGF明显增高,两者具有并联协调作用,它们呈正函数相关[20],提示EPO可加剧PDR视网膜缺血和新生血管生成,从而加速PDR的进展。
2.1 磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)信号通路PI3K/Akt信号通路可调节血管生成因子、促炎因子的表达及相关细胞的功能,参与多种酶生物学效应,介导正常血管及病理性血管的形成[21]。Liu等[22]研究发现,DR患者中血-视网膜内屏障(inner blood-retinal barrier,iBRB)完整性的破坏是通过VEGF/血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR2)/络氨酸蛋白激酶(sarcoma,Src)信号通路磷酸化水平增加,导致血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)表达的降低诱导的,EPO可通过抑制VEGF/VEGFR2/Src信号通路,促进DR大鼠VE-cadherin的表达从而维持视网膜的屏障功能,发挥DR早期血管保护作用。Xie等[12]发现,DR大鼠视网膜中激活的小胶质细胞吞噬内皮细胞,导致脱细胞毛细血管形成,引起血管渗漏,而EPO可以提高Src/Akt/肌动蛋白素(cofilin)信号通路相关分子 Src、Akt、cofilin的磷酸化比例,抑制小胶质细胞吞噬功能,从而保护iBRB,抑制血管渗漏。先前研究已证实缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)作为PI3K/Akt信号通路的关键下游蛋白,通过诱导下游蛋白质EPO的表达来阻止高糖环境下血-视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)的破坏,同时促进营养物质和氧气转运,从而保护细胞免受缺氧损伤,抑制血管生成[23-24]。另外有学者发现EPO还可通过抑制HIF-1α/VEGF信号通路,保持iBRB的完整性并减弱血管渗漏[25-26]。适量的EPO可以选择性下调IL-1β、TNF-α、IL-6、VEGF等炎症相关因子,可保护实验性DR模型BRB完整性[27]。
2.2 氧化应激通路核因子相关因子2(NF-E2-related factor,Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)信号通路 Nrf2/ARE信号通路是一种普遍存在的、进化保守的信号通路[28-29]。Nrf2作为氧化应激的感受器,在抗氧化应激中起重要作用[30]。Nrf2对氧化应激高度敏感,可特异性识别并结合ARE,促进相关抗氧化基因的转录,激活血红素氧化酶(heme oxidase,HO-1)和醌氧化还原酶(quinone oxidoreductases,NQO-1),清除多余的氧自由基,减轻氧化应激损伤[31]。研究发现,EPO可过通过影响实验性DR大鼠氧化应激通路相关分子,提高Nrf2、HO-1和NQO-1的表达水平,减少超氧化物和其他自由基产生,下调谷胱甘肽过氧化物酶,降低磷酸化Akt和热休克蛋白水平,降低视网膜Ang-2表达,减少靶细胞氧化应激和亚硝化应激,从而减少DR神经细胞损伤以及周细胞的凋亡[32]。
2.3 非受体型络氨酸蛋白激酶(non-receptor tyrosine protein kinases,JAK)/信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信号通路 JAK/STAT信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡,在免疫反应、炎症反应及微血管内皮细胞损伤中发挥重要作用[33]。细胞实验发现,上调JAK通路后可以有效促进EPO引起的RPE胞质Ca2+内流,从而维持BRB的稳定[34]。EPO通过抑制参与JAK/STAT信号通路的分子,包括重组人B细胞淋巴瘤因子2XL(recombinant human B-cell leukemia/lymphoma XL,Bcl-xL)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic protease,Caspase)-3、Caspase-9、蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase type 2A,PP2A)、抑癌基因p53、磷酸酶基因(phosphatase gene,PTEN)和沉默信息调节因子(silent information regulator 1,SIRT1)等,抑制细胞凋亡,发挥血管神经保护作用,延缓早期DR进展[11,35]。Wang等[36]发现,EPO能有效抑制高糖介导的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)中Caspase-9和Caspase-3的上调,降低Bax/Bcl-2比值,从而抑制RGC的凋亡。
2.4 细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路 ERK信号通路是细胞生物学中研究最多的信号通路之一[37],控制着许多重要的细胞生物学过程。既往研究证实,表皮生长因子通过与其受体结合后激活肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)/丝裂原活化蛋白激酶-胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase-extracellular signal-regulated kinase,MEK),激活的 MEK 使ERK磷酸化,进入细胞核影响基因转录翻译[38]。免疫组化分析证实,DR早期缺氧环境下VEGF可激活ERK的磷酸化,细胞中磷酸化ERK-1/2与总ERK-1/2的比值显著降低,调节血管通透性和细胞迁移,从而促进内皮细胞的增殖及新生血管形成,而EPO可通过逆转这一比值发挥其血管保护作用[39]。Shen等[40]发现,EPO可能通过ERK通路下调Bax,上调Bcl-2相关死亡促进因子磷酸化和Bcl-xL表达,发挥视网膜神经保护作用。锌是人体中第二丰富的微量元素,在视网膜神经纤维层、RPE和脉络膜中广泛存在,参与视网膜的多种功能,在视网膜生理和病理过程中起着重要作用,如光传导、视觉周期和神经传导等[41]。ZnT8作为锌的转运蛋白之一,可将细胞内的锌转运至细胞外,在调节细胞锌稳态中发挥着重要作用。Xu等[39]研究表明,EPO通过激活ERK通路上调ZnT8的表达,维持细胞内锌的稳态,保护高糖环境下视网膜细胞免受过量锌引起的损伤,提高细胞活力,减少细胞凋亡。
2.5 氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路 JNK蛋白是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的成员,由 MAPK8、MAPK9和MAPK10 3个基因编码,此信号通路调控多种生理过程,包括炎症反应、细胞分化、细胞增殖、细胞死亡等[42-43]。JNK信号通路由多种细胞内外刺激(如细胞因子、病原体、激素、氧化应激、DNA损伤等)激活,它们可使多种细胞质和核底物发生磷酸化,如MAPK3的磷酸化[44]。Qi等[45]通过用EPO干预敲除酪氨酸蛋白磷酸酶非受体1型(tyrosine protein phosphatase nonreceptor 1,PTPN1)和 PTPN11基因编码的细胞发现,EPO可通过提高PTPN1和PTPN11的表达水平来抑制JNK信号通路,从而显著逆转高糖诱导的RGC凋亡,发挥神经保护作用。Zhang等[46]通过细胞实验发现,EPO通过阻断缺氧诱导JNK的磷酸化,上调紧密连接蛋白和闭合蛋白的表达,保护BRB,从而减少血管渗漏,延缓DR进展。
Samson等[35]研究显示,转染EPOsiRNA的RPE细胞中VEGF表达下调。视网膜缺氧且VEGF高表达是PDR的主要诱导因素,EPO可增强VEGF的作用,从而促进新生血管形成,使PDR进一步恶化[34,47]。Gholamhossein等[48]和He等[13]发现,PDR患者血浆EPO水平明显高于NPDR患者,EPO水平与DR分期相关,同时PDR患者视网膜增殖膜中EPOR表达显著高于视网膜静脉阻塞患者,且PDR患者术后最佳矫正视力与EPOR表达呈正相关,进一步提示EPO与PDR患者的预后相关。
目前,基于靶向EPO的相关应用仍处于实验阶段,有学者发现视网膜下注射腺相关病毒介导表达人源EPO(AAV2-CMV-hEPO)的基因,可使血清中具有生物活性的EPO蛋白增加,从而发挥其血管神经保护作用[49]。EPO衍生的肽ARA290[50]、氨甲酰化EPO(CEPO)[47]通过抑制RGC及小胶质细胞凋亡和延缓血管退行性病变,使实验性DR大鼠的视网膜电图b波振幅和振荡电位下降,从而发挥血管神经保护作用。Li等[51]通过对5例DR患者行EPO玻璃体腔注射,发现短期内疗效可观,但存在样本量较少的局限性。因此,携带EPO基因或其他特定基因的AAV2载体有望成为DR长期预防或辅助治疗的潜在治疗方式,但EPO在DR中的临床应用仍然需要大量的临床试验来验证。
DR是糖尿病的常见并发症,可引起不可逆的视网膜损伤。EPO作为一种糖基化细胞因子,在DR发展早期具有明显的血管神经保护作用。在PDR中,可导致病理性血管的生成以及BRB的破坏,加剧PDR的进展。在DR发病机制中EPO所参与的各种信号通路并不是孤立存在的,往往存在多个信号通路间的协同作用。近年来,针对DR虽然有非常成熟的治疗方式,如抗VEGF药物和皮质类固醇药物玻璃体腔注射、视网膜激光光凝、玻璃体切除术等,但仍然存在大部分DR患者出现治疗效果不佳以及预后不理想的情况。DR发病机制中EPO相关信号通路的不断探索为DR的治疗提供了更多潜在的靶点,这些发现对延缓DR进展以及治疗具有非常重要的临床意义。