动脉粥样硬化免疫相关调节治疗的研究进展

马 灏，申晓彧

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)为一种以大、中型动脉内膜中层内炎性细胞活化、脂质沉积异常、斑块为特征的慢性炎症性疾病[1]。过去的几十年中，科学家们集中于对脂质代谢紊乱、炎症反应级联、血管平滑肌细胞异常增殖等研究并取得一定进展。如今，在构建的小鼠动脉粥样硬化模型中，发现大量单核细胞和T、B细胞被募集到病变部位，增强炎症反应的同时促进动脉粥样硬化病变的开始和进展，其中尤为重要的有辅助性T细胞17(Th17)与调节性T细胞(Treg)，由转化生长因子-β(TGF-β)和白细胞介素(IL)-6分化的Th17细胞被认为可产生促炎细胞因子，具有促动脉粥样硬化的特性[2-3]。同样，在动脉粥样硬化病变中发现的Tregs[4]，通过分泌IL-1、TGF-β抑制Th17的免疫反应。表面上看Th17与Treg是一对截然相反的免疫细胞，但进一步研究发现Th17细胞可通过改变其特征性转录谱并通过TGF-β信号和芳香烃受体(AHR)的作用获得有效的调节特性，从而分化为Treg细胞[5]。这意味着某些细胞亚群可以通过互相转化维持体内平衡状态。那么，Th17与Treg细胞究竟是一种什么关系，动脉粥样硬化中两者的数量及功能情况如何，是否可通过研究相应信号通路实现对Th17/Treg比例影响，从而达到对动脉粥样硬化的调控。本研究综述动脉粥样硬化过程中Th17及Treg变化情况，较为典型的影响Th17/Treg比例的相关通路，以及动脉粥样硬化疾病免疫相关的治疗现状，从而为新型的抗动脉粥样硬化治疗提供理论支撑。

1 动脉粥样硬化发生过程中相关免疫细胞的变化情况

研究证实，动脉粥样硬化在病变过程中，斑块内储存有大量CD4+T细胞，且大部分是由幼稚的CD4+T细胞分化成不同的细胞亚群，如效应T细胞(Th1、Th2、Th17等)和Treg细胞[6]，现就Th17和Treg这两种典型细胞展开论述。

1.1 Th17细胞 Th17细胞的许多致病功能都归因于IL-17的分泌，包括中性粒细胞的募集、先天免疫细胞的激活、增强B细胞功能以及诱导肿瘤坏死因子、粒细胞集落刺激因子和白细胞介素-1β的促炎细胞因子的释放[7]。此外，IL-17信号传导诱导趋化因子和其他炎症介质的表达和/或释放，包括细胞间黏附分子1(ICAM-1)、前列环素E2以及通过诱导基质金属蛋白酶(MMPs)和抗微生物肽促进组织损伤[8]。除了IL-17，Th17细胞还可以分泌IL-21、IL-22、IL-25和IL-26[9]。但IL-17被认为是免疫反应和疾病中的一种重要调节剂，在体内具有调节趋化因子表达和组织炎症的关键功能，已被人们所熟知。此后，大量实验也证实了其在促进和增强炎症(包括自身免疫组织损伤)中的关键作用，如多发性硬化(MS)[10]、类风湿关节炎(RA)[11]、系统性红斑狼疮(SLE)[12]和呼吸道炎症疾病中均发现Th17及其分泌细胞因子IL-17的过度表达，在实验室模型中同样得到验证。之后， Wang等[13]使用高脂血症病人的临床血液样本和动脉粥样硬化小鼠模型，证明IL-17在动脉粥样硬化早期至晚期的促动脉粥样硬化作用。在高脂血症条件下，Th17细胞被激活，并在主动脉、血液、脾脏和骨髓中产生炎性细胞因子，特别是IL-17，诱导巨噬细胞和中性粒细胞向动脉粥样硬化病变迁移，并加剧动脉粥样硬化的发展。

1.2 Treg细胞 20世纪90年代中期，一个具有调节功能的Th细胞的新亚群被发现并命名为Tregs[14]。大量研究证实，Tregs在许多炎症和自身免疫疾病中重要免疫调节功能，包括哮喘[15]和1型糖尿病[16]。Treg介导的免疫抑制的几种机制已被确定，包括：抗炎细胞因子的分泌、抑制性受体的表达和细胞因子剥夺[17]。其中对于Treg细胞发挥作用密切相关的细胞因子包括TGF-β、IL-10。实验证实，TGF-β主要由nTreg和Th3细胞产生，包括B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和许多其他非免疫细胞在内也可以产生这种细胞因子[18]，通过在旁分泌反馈环中诱导叉头蛋白p3(Foxp3)的表达，从而将幼稚T细胞(Th0)分化为iTregs[19]。TGF-β和Foxp3之间的正反馈回路在维持外周耐受性[20]中起着关键作用，并且是Tregs[21]产生和维持作用的关键。IL-10由先天和适应性免疫系统的细胞表达，包括CD4+和CD8+T细胞、巨噬细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞(NK)、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞[22]。在CD4+T细胞中，Treg细胞是这种细胞因子[23]的主要来源，IL-10通过自分泌过程对Treg[24]细胞的产生和维持至关重要[25]。目前，已经在炎症性肠病(IBD)、自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的1型糖尿病和超敏反应/变态反应模型中研究了Tregs产生的IL-10的作用机制，并证明其在相关疾病中的调节作用[23]。Tregs的生成受损和免疫抑制功能障碍导致免疫稳态失调和耐受性丧失[26]，这严重驱动了动脉粥样硬化病变的发生和进展[27]。相应地，颈动脉粥样硬化和急性冠脉综合征病人出现Treg数量减少[28-29]，而低Treg频率与长期心血管风险呈正相关[30]。来自实验小鼠研究的大量证据表明，Tregs积极调节动脉粥样硬化的形成。剥夺Tregs 4～8周的小鼠出现动脉粥样硬化斑块的增大和易损性恶化[31]。反之亦然，Tregs的过继转移减少了斑块负担，增强了病变稳定性，并降低了斑块破裂的发生率[32]。

1.3 Treg与Th17的关系 Treg细胞抑制炎症的作用虽有目共睹，但其发挥作用还要得益于其他细胞的共同参与，保持一种动态平衡。例如，Treg和Th17细胞之间的不平衡与动脉粥样硬化、急性冠脉综合征密切相关[33]。Th17和Treg细胞之间的平衡依赖于转录因子，尤其是维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)和信号转导与转录激活因子3(STAT3)，以及Foxp3和信号转导与转录激活因子5(STAT5)[34]。此外，Treg/Th17与血清氧化型低密度脂蛋白、超敏C反应蛋白、脂蛋白a和肌酸激酶同工酶水平呈负相关[33]。Treg/ Th17比值的预测特异性和敏感性使其成为早期诊断的潜在指标[33]。氧化型低密度脂蛋白通过Fas/ FasL途径以及核转录因子κB(NF-κB)相关的Th17增殖诱导Treg凋亡，从而影响Treg/Th17的比例[33]。此外，Treg细胞和Th17细胞之间的平衡受到高迁移率族蛋白box-1(HMGB1)的调节，HMGB1是一种内源性损伤相关分子模式分子，从坏死或损伤的细胞中释放，刺激平滑肌细胞或内皮细胞中细胞因子、黏附分子、趋化因子、脂质介质和纤溶酶原激活剂的表达和/或分泌[35]。动脉粥样硬化病人血清中HMGB1水平明显升高[35]。重组HMGB1诱导Treg细胞凋亡并促进Th17细胞，最终导致Treg/ Th17细胞比例的整体下降[35]。此外，据报道，抗炎细胞因子IL-35可减轻动脉粥样硬化[36]。在小鼠中，IL-35促进Treg水平，阻止Th17水平，并且不影响Th1或Th2水平[36]。Treg/Th17平衡不是固定不变的，而是随动脉粥样硬化不同阶段而变化[37]，且两者之间在一定条件下可相互转化，加速平衡状态的实现。

2 相关信号通路对动脉粥样硬化发生过程中免疫细胞(Th17/Treg)的调节

2.1 肌醇磷脂-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路 PI3K/Akt信号通路参与细胞生长、细胞激活和炎症反应的许多方面，是维持细胞正常基本功能的重要信号通路之一。最早在人类癌症中发现其异常失控，癌基因的扩增或突变导致致癌信号过度激活，以及由于缺失或点突变而导致的肿瘤抑制信号功能的丧失而致病。之后的研究表明，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导与许多免疫性和炎症性疾病紧密相关，并控制多种效应T细胞命运，包括Th1、Th2和Th17细胞[38]。在CD4+T细胞中，抑制PI3K和/或mTOR 复合物1(mTORC1)可促进Treg分化，而激活PI3K和/或mTORC1则促进Th17细胞分化[39-40]。因此，在免疫系统发育过程中，mTOR蛋白的缺乏导致Th1、Th2和Th17细胞的产量减少，Tregs生成增加，以及特异性转录因子[如T盒子转录因子(T-bet)、GATA结合蛋白3(GATA3)和RORγt]的合成减少。PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活可能部分抑制Tregs的分化，同时促进Th17细胞的分化。Gao等[41]通过对围生期双酚α对免疫系统的作用研究，证实了双酚α处理(0.2 μg/mL或2.0 μg/mL)的雄性后代小鼠脾脏中Th17细胞的百分比显著增加，Tregs的百分比降低，暴露于更大剂量的双酚α，雄性子代小鼠脾脏中PI3K、硫酸化Akt(Ser473、T308)、mTOR和硫酸化mTOR的表达水平均升高。Li等[42]实验证实了重组人脑钠肽通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制CD4+T细胞增殖而起到减轻心肌缺血再灌注损伤的作用。

2.2 蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信号传导及转录激活蛋白(STAT)通路 JAK/STAT信号通路是一条普遍表达的细胞内信号转导通路，参与细胞增殖、分化、凋亡和免疫调节等许多重要的生物学过程。越来越多的证据表明，JAK/STAT信号通路的持续激活与许多免疫性和炎症性疾病密切相关，但具体机制尚不清楚。JAK/STAT是受细胞因子调控的主要信号通路，对启动先天免疫、协调获得性免疫机制、最终抑制炎症和免疫反应至关重要[43]。Luger等[44]研究发现，JAK/STAT通路被认为是调节Th1和Th17细胞分化和功能的主要机制，而Th1和Th17细胞被认为是自身免疫性脑脊髓炎发生的关键效应细胞。IL-6激活并刺激STAT3的酪氨酸磷酸化，STAT3是诱导致病性Th17细胞的关键转录因子[45]。IL-2是Treg发育和维持的重要生长因子。缺乏IL-2或其受体亚单位的小鼠，IL-2Rα(CD25)和IL-2Rβ(CD122)，CD4+CD25+Treg细胞存在缺陷，并发生类似于Foxp3-/-小鼠的自身免疫性疾病[46]。但是，IL-2对于Treg细胞的发育是必不可少的，因为在IL2-/-小鼠和IL2ra-/-小鼠中存在一些表达Foxp3的细胞，这表明其他细胞因子也参与其中[47]。IL-2通过STAT5信号转导抑制T辅助细胞17的生成，STAT3水平的降低导致Th17分化受损。IL-2使Treg细胞和Th17细胞这两个细胞系保持动态平衡，可以确保免疫反应不会对宿主组织造成损害。在CD4+T细胞中，STAT3信号传导是TH17细胞分化所必需的[48]。STAT5信号抑制TH17细胞分化[49]，但增强多种效应CD4+T细胞亚群的分化，包括Treg细胞[50]、TH2细胞[51]和TH1细胞[52]。

3 动脉粥样硬化免疫相关治疗简述

来自实验小鼠研究的大量证据表明，Tregs积极参与调节动脉粥样硬化的发生发展。剥夺Tregs 4～8周的小鼠出现动脉粥样硬化斑块的增大和易损性恶化[31]。然而，Th17细胞被认为参与了自身免疫性疾病，如多发性硬化。所以相较Th17细胞，Treg细胞在维持外周耐受性中起关键作用。因此，Treg细胞和TH17细胞之间的平衡决定了Th17细胞驱动的疾病的严重程度，有望成为治疗自身免疫性疾病的靶点。

蛋白激酶CK2的药物抑制和遗传消融改善了实验性自身免疫性脑脊髓炎的严重程度和复发率。此外，CK2抑制或遗传消融阻止TH17细胞的发育并促进Treg细胞的产生。从分子水平上讲，抑制CK2导致STAT3磷酸化减少，IL-23受体、IL-17和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)表达强烈减弱。因此，这些结果确定CK2是Th17细胞发育的节点，并表明该激酶是治疗Th17细胞驱动的自身免疫反应的潜在治疗靶点。

在炎症损伤的低氧环境中，T细胞内可用的缺氧诱导因子-1水平增加，这可能是由于炎症条件下通过活化的STAT3增强缺氧诱导因子-1的转录和低氧张力下缺氧诱导因子-1的稳定[53]。累积的缺氧诱导因子-1在炎症损伤中Th17细胞的偏斜分化中起着三管齐下的作用，最终转录激活Th17亚群的遗传程序，同时抑制Treg程序，推动Th17/Treg的群体比例朝向Th17子集[54]。缺氧诱导因子-1在自身免疫性疾病免疫调节中的关键作用已引起人们的关注，成为一个潜在的治疗靶点。缺氧诱导因子-1靶向药物可分为缺氧诱导因子-1-DNA相互作用抑制剂、缺氧诱导因子-1 mRNA转录/翻译抑制剂、缺氧诱导因子-1介导的转录活性抑制剂或脯氨酰羟化酶激活剂[55]。没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)通过抑制STAT3和缺氧诱导因子-1α减轻小鼠关节炎，从而增加Treg相对于Th17细胞的比例[56]。

将Treg细胞转移至病人体内的能力被认为对探索这些细胞的治疗潜力非常有益。体外扩增的CD4+CD25+CD127-Treg细胞的过继转移已经在移植物抗宿主病(GvHD)治疗中得到证实[57]。在首次人体试验中，Treg细胞从家庭供体的红细胞沉降率棕黄层中分选出来，体外扩增，并转移到患有GvHD的受体中[57]。在慢性GvHD病人中，转移与外周血中Treg细胞水平的升高和细胞因子水平的降低有关[57]。即使患有急性GvHD，症状也暂时稳定[57]。Brunstein等[58]考虑了在脐带血造血干细胞移植中使用脐带血衍生的CD4+CD25+Treg细胞体外扩增天然Treg细胞的安全性和有效性。Treg细胞是从一个脐带血单位中分离出来的，该单位的人类白细胞抗原为4-6/6，与每个病人相匹配[58]。Treg输注没有观察到剂量限制毒性，机会性感染或复发风险也没有受到不利影响[58]。总之，目前通过各种方法调节Treg/Th17细胞比率为动脉粥样硬化免疫相关治疗的核心观点。

4 小结及展望

动脉粥样硬化作为一种经典的慢性炎性疾病，近年来，随着免疫相关研究的深入，发现动脉粥样硬化发生发展中免疫相关细胞(尤其CD4+T细胞各种亚型)所发挥的关键作用，其中最为重要的包括Th17、Treg细胞，大量实验及研究也已证实了其在动脉粥样硬化进展中的数量的变化情况及其发挥作用的机制，追本溯源，相关免疫细胞调节通路成为研究热点，通过对信号通路上分子蛋白干预，实现对免疫功能调节，最终为治疗动脉粥样硬化提供新的方向与可行性，这其中就包括PI3K/AKT、JAK/STAT等相关通路，尽管从理论上讲，确实相较于常规治疗动脉粥样硬化而言不失为一种创新的想法，但是针对通路上信号靶点调节影响免疫，从而使Th17/Treg达到某种平衡，实现对动脉粥样硬化的治疗还有很长的路要走，毕竟，针对于人体典型信号通路，存在范围十分广泛且作用效果并非单一，外加不同信号通路之间的串扰也使其不那么容易，因此，在今后的研究中，针对不同的信号路径展开探究，寻求特异性靶点，将免疫相关治疗所引发的副作用及不良效果降至最低。