关于高能重离子束辐射诱变北方粳稻育种方法的思考

杨福 李景鹏 余丽霞 周利斌

（1 中国科学院东北地理与农业生态研究所，长春 130012；2 中国科学院近代物理研究所，兰州 730000；第一/通讯作者：yangfu@iga.ac.cn）

农作物辐射诱变是指利用各种射线对生物体进行辐射诱发产生变异，然后根据育种目标对后代突变材料进行筛选鉴定，直接或间接选育新品种的过程。常见的辐射诱变主要有x 射线、γ 射线、中子、离子束及多种因素结合的空间诱变[1]。在重离子束辐射农作物诱变育种方面，1989年余增亮等[2]首创了低能重离子束（30 MeV/u 以下）注入技术用于农作物品种改良，之后研究人员先后培育出水稻、小麦、玉米等农作物新种质及品种，取得了较好的社会经济效益[3-4]。20世纪90年代，中国科学院近代物理研究所利用兰州国家重离子加速器（HIRFL）装置对农作物干种子进行重离子束辐射，先后培育出优良的小麦及甜高粱等农作物品种，并得到了推广应用[5-6]。重离子是指重于元素周期表中2 号元素He 并被电离的粒子[7]，将其通过大型加速器装置加速而形成具有较高能量的射线就是高能重离子束（80 MeV/u 以上）[8]。实践证明，高能重离子束辐射作为一种新的诱变技术，在穿过生物介质时，将大量能量沉积在其径迹上，引起DNA 单链或双链断裂、碱基突变和缺失[7，9]，造成DNA 链的错误修复或非同源末端重组[8]；它不仅具有能量高、穿透能力强、生物效应高、损伤小等特点，与以往辐射技术相比，辐射诱变的效率比60Co-γ 射线等要高出10 倍[1，10]，可大幅度提高突变率，使突变率达到5.7%以上[11]。2013年中国科学院东北地理与农业生态研究所与中国科学院近代物理研究所紧密合作、优势互补，开展了高能重离子束（12C6+）辐射北方粳稻的诱变育种工作。经过10年的研发，创建了高能重离子束辐射北方粳稻“少而精”诱变育种技术体系，开辟了一条水稻育种新途径。首先，精选亲本，选择遗传背景丰富、一般配合力高、抗稻瘟病、综合性状优良的材料作辐射亲本；其次，辐射亲本种子量少，一般为200～250 粒，而60Co-γ 射线辐射通常需要几千粒或更多[12]；再次，M1、M2种植群体小，一般M1几十株，M22 000 株左右；最后，后代材料尽早抓住少数有益突变性状，跟踪不放。目前，利用该技术已获得1 000 多份突变体，变异类型丰富，优良性状多。自2020年开始，先后有辐射优良突变品系东稻122、东稻275、东稻812等通过吉林省农作物品种审定。为了凝练研究成果，使高能重离子束辐射北方粳稻“少而精”诱变育种技术体系得到更好应用，笔者将高能重离子束辐射北方粳稻诱变育种的经验及技术层面的一些问题归纳总结，期望为今后水稻高能重离子束辐射诱变育种工作提供一些参考。

1 辐射亲本的选择

大量育种实践证明，亲本的选配是育种成败的关键。优良作物品种的培育必须站在“巨人的肩膀”上，高能重离子束辐射亲本的选择也是一样。常规育种中，玉米有骨干自交系，水稻也有骨干亲本之说法，目前最先进的作物分子设计育种也需要引用“底盘品种”的概念。理想的亲本是各育种单位经过长期育种实践筛选、总结出来的，一般亲本之一都具有在生产上应用时间较长、推广面积大、综合性状好等特点。但长期的育种实践表明，综合性状好的品种不一定是好的亲本，而好的亲本除综合性状优良之外，一般配合力也要高。总之，辐射亲本选择的“试金石”应该是辐射后能够诱变出符合水稻育种目标的优异突变性状相对要多，短时间内能培育出优良突变新种质或新品种。这需要长期育种实践经验的积累，更需要从分子水平上系统分析骨干亲本/品种的重要基因区段、关键基因及等位基因（群）的遗传变异规律，并开发高效的分子标记，做长期的基础或应用基础研究工作。

目前，高能重离子束辐射北方粳稻亲本的选择与其它育种方法一样，应倾向于选择综合优势强、抗稻瘟病、品质优且一般配合力高的材料。笔者结合多年常规杂交组配后代亲本分布情况分析发现，吉林省通化市农业科学研究院选育的通禾899 综合性状优良，且一般配合力高，后代材料遗传性好。2013年选用通禾899作为高能重离子束辐射亲本，辐射诱变后代材料变异类型丰富，获得了大量的突变种质资源和优良品系，并从2020年开始，陆续审定了东稻122、东稻275、东稻812 和东稻862，还有大量后代材料正在抗稻瘟病、耐盐碱及品质鉴定过程中。此外，近些年还选择了30 多个在农业生产中推广面积较大、国内优质水稻获奖品种作辐射亲本，也取得了良好的诱变成果，创制了许多优异突变后代。

2 辐射方法

2.1 辐射部位

主要以辐射水稻种子的胚为主。水稻主要靠种子繁殖，胚是由受精卵（合子）发育而成的新一代植物体的雏型（即原始体），具有胚芽、胚根和盾片等器官，是种子中最重要的组成部分，水稻的遗传信息通过胚传递给后代；另外，种子还具有容易携带、辐射方便、体积小、易保存、繁殖系数高等特点，是最佳的辐射部位。

2.2 辐射数量

不同的辐射源辐射处理种子的数量有很大的差异。如60Co-γ 射线等，一般辐射几千粒种子甚至更多，而利用高能重离子束辐射处理水稻种子的数量较少。按照笔者的经验，如果每个M1单株分蘖10～15 个，每穗100 粒，按照每穗结实率5%计算，每穗结实5 粒，1个M1的半不育株大约结实50～75 粒，如果有50 个M1单株，可产生至少2 500 粒种子。按出苗率80%计算，可得苗2 000 株，可插100 m2本田，按平均突变率5%计算，可产生100 份突变株。因此，一般处理200～250粒为宜。如2013年3月采用高能重离子束（12C6+）辐射通禾899 种子150 粒，播种成活23 棵苗并插秧，结实均为半不育植株，平均结实率5%，共收获种子1 400粒左右，下年种植成M2代，出现大量变异株，秋季选拔了78 份变异单株，突变率5.7%。

2.3 辐射剂量

适宜的辐射剂量是获得良好诱变效果的前提和保证。如60Co-γ 射线等引起的辐射诱变，在一定剂量范围内，突变率与剂量呈正相关。近几年，利用兰州重离子加速器装置（HIRFL）生物辐射终端（TR4），采用高能重离子束碳（12C6+）辐射水稻种子，胚部朝上，能量80 MeV/u，剂量率20 Gy/min，摸索出150～180 Gy 为适宜辐射剂量。目前，在辐射剂量的选择上一般广泛采用半致死剂量，即照射后植株的成活率与死亡率各占50%左右，结实率在30%以下[12]。半致死剂量是对大量被诱变材料M1代植株的成活率或死亡率进行统计而得出的，在对一个新的植物或农作物材料进行辐射诱变时，必须先摸索出半致死剂量，做到有的放矢。但半致死剂量只是体现在M1植株的成活率上，并不说明只有采用半致死剂量辐射后代就一定能够出现较多的有益突变，辐射诱变育种的最终目标是使被辐射材料发生更多的有益突变，从中选择符合当前育种目标需要的材料进而培育出新品种。因此，在高能离子束辐射诱变育种实践中不需过分关注半致死剂量，半致死剂量只作为辐射剂量的参考，至于半致死剂量与出现有益突变的概率有没有直接的相关性还有待进一步研究。“因事而宜”，无论剂量如何，只要在诱变后代材料中出现有益突变，就抓住不放，跟踪到底。如在进行高能重离子束碳（12C6+）辐射诱变北方粳稻的育种科研工作中，一般采用辐射剂量150～180 Gy，M1植株的成活率及结实率都明显降低，一般成活率在10%～30%之间，结实率在30%以下，但后代材料都有不同类型的突变体出现，只是突变率高低有差异。至于哪个辐射剂量产生的有益突变多还需要今后进一步跟踪调查并进行科学的统计分析。

3 后代材料的种植与选择

确定M1代种植群体大小是根据M2代群体所需数量来决定，而M2代群体大小以是否能出现符合育种目标要求的优良类型和植株为依据，一般M2群体要10 000 株以上[12]。从以往的经验看，采用60Co-γ 射线辐射水稻后代材料的种植规模相对较大，尤其是M2群体。昭道祖[13]报道的我国著名水稻品种原丰早是采用60Co-γ 射线辐射科字6 号干种子，从M1每个主穗上收取几粒种子，M2代种植群体达到14 400 个单株，从中选出4 个早熟株，其中1 单株比原品种早熟40 多d，性状良好（代号692-1），经过5 个世代、2年多的时间育成比原品种早熟45 d 的原丰早；夏英武等[14]报道了水稻品种浙辐802 在M1代共收获6 kg 种子，M2代种植成20 万株，采用混合法经多次早熟性选择育成。后代材料种植群体，除了需要增加育种试验田面积之外，更重要的是大大增加育种工作者田间选种的工作量，尤其是在东北进行水稻育种，秋季决选是一年中重要的环节，秋季田间决选应该下“绣花”功夫。但东北秋季初霜期早，如黑龙江省第二积温带常年初霜期为9月25日，吉林省长春地区常年初霜期为9月28日[15]，每年秋季决选时间非常短，如果群体过大、不同生态区试验点次多，难以集中精力对好的材料进行耐心细致选拔，会导致“走马观花”，甚至搞“突击”，严重影响决选效果。采用高能重离子束辐射诱变技术M1、M2代种植群体规模较小，一般M1种植几十株，M2代种植2 000 株左右。如水稻新品种东稻122、东稻275 等的选育是利用高能碳重离子束（12C6+）辐射150 粒通禾899 种子，M1成活23 株苗，成活率15.3%，M2代种植1 400 株，按变异性状如抽穗期、株高、穗型、粒型、芒的有无等选拔了78 份变异单株，再经3 代种植稳定后选育出来的。每个世代选择都从群体着眼，个体入手，一旦出现优良株系就跟踪不放，一跟到底。此外，既要选品种，也要选中间材料，两条腿走路，同时开展多点试验，边试验、边示范、边推广。

4 其他一些问题

4.1 辐射亲本的敏感性

同一作物的不同品种对辐射的敏感性不同[5]。水稻种子辐射后M1植株损伤程度因处理材料不同也表现不同，有的材料对辐射有较高耐性，反应迟钝，有的则表现高度敏感。如绥粳18、中科发5 号、通禾66 等表现钝感，龙稻18、吉粳809 等表现敏感。但无论是敏感还是钝感，不同材料对辐射敏感性差异的产生原因还不十分清楚。王佳琪等[16]选取了12 个东北粳稻品种进行高能碳离子束（12C6+）辐射处理，结果表明，与通禾66相比，吉粳809 对高能碳离子束辐射更敏感，而抗氧化系统如其H2O2、O2·-和丙二醛（MDA）含量在二者辐射敏感性差异中起着重要作用。

4.2 M1 材料的天然杂交

水稻雄性不育是指雄性器官发育不完善，花粉异常，不能自交结实，而雌性器官发育正常，能够接受外来花粉正常结实的现象。利用EMS 诱变水稻品种黄花占种子，经过M1、M2代连续田间筛选得到雄性不育突变体材料[17]；利用60Co-γ 射线辐射诱变粳稻品种松香早粳种子也获得了水稻雄性不育突变体[18]。在诱发小麦突变后代过程中也难以避免受窜粉造成的天然异交混杂[19]，CALDECOTT 等[20]的实验证明，在利用热中子对燕麦Markton 品种进行辐射诱变后代中，很多突变体可能不是辐射来的，而是由于辐射导致雄性器官不育而雌性器官还具有生理功能、可接受外来授粉引起的。以此推测，水稻种子经高能重离子束辐射后，一般生理损伤将在M1代出现，如果种植时不设置隔离，个别M1单株也很可能出现小穗雌性器官发育正常而雄性器官发育受阻或花粉败育等现象，也可接受外来可育花粉进行随机天然杂交。把这部分材料种植成M2代时实际就是杂交的F1，而真正的高能重离子束辐射导致的半不育M1，在种到M2代时会出现突变株，这种天然杂交的F1很可能也当作突变材料被选出来，下一年种植成M3代实际是杂交的F2代，会发生分离。而真正选出来的M2代变异单株下一年种植成M3代，按照诱变育种的一般规律M3应该是基本稳定的，可推断这个M2代单株来源的M3株系行是真正的辐射诱变来的，因此，由所选的M2代单株下一年全部种成M3株系行，从其稳定情况来推测M2代真实的突变率。如果是单基因引起的“隐性大突变”，往往突变性状在早期世代的M3、M4就基本稳定了，这部分突变基本可以断定是由高能重离子束辐射诱变来的；如果在M5、M6代才开始稳定，不排除突变是天然杂交来的。确切的结果，还需要把被高能离子束辐射处理的M1代隔离和不隔离种植，分析下一年M2代的突变情况才能得出令人信服的结论。

4.3 高世代的“疯狂分离”

从笔者的研究来看，一般高能重离子束辐射后代大多数在早代（M3～M4）就基本稳定，也有在M5～M6代稳定的，这部分材料不排除有外来花粉天然杂交的可能，但仍然有少部分在高世代如M9代及以后世代发生分离或疯狂分离的现象。推测，如果辐射导致花粉败育雌蕊正常从而产生了天然杂交，按照一般的后代分离规律在M5～M6代也基本稳定了（排除天然远缘杂交），而M9代以后仍然分离或疯狂分离的现象很难用常规杂交育种后代的分离规律来解释。笔者认为，这部分材料很有可能还是高能重离子束辐射诱变来的，因为高能重离子束能量高、穿透能力强，能够引起被辐射水稻DNA 单链或双链断裂等团簇损伤[25]，从而引起遗传物质发生复杂变化而导致的。

4.4 突变材料的变异性状

据统计，与其辐射亲本通禾899 相比，突变材料在抽穗期、株高、株型、穗型、粒型、穗粒数、千粒重等性状上普遍发生了变异[11]。亲本生育期为146 d，突变材料生育期变异在130～151 d 之间，如2020年通过吉林省品种审定的水稻新品种东稻122 生育期为132 d，比通禾899 早熟14 d，且耐盐碱性突出；2022年审定的东稻812 生育期138 d，比通禾899 早熟8 d，且穗粒数更多。

4.5 突变材料的分子选择

通过人为对突变材料进行田间表型选择是有效的，但增大了育种者的工作量，有时还把环境因素影响的性状选择出来，准确性不高。高通量测序鉴定技术是未来突变体筛选的发展趋势，应逐步建立基于定向诱导基因组局部突变技术（TILING）和高分辨溶解曲线分析技术（HRM）等突变新基因的筛选技术体系。按我们的经验，在突变体早期M2代对单基因控制的质量性状，如长粒、香味、抗稻瘟病等性状开展分子标记辅助选择，能够减少工作量，缩短育种时间。

4.6 辐射亲本的重复处理

目前，辐射诱变的缺点是突变的方向不确定，带有较大的随机性，但辐射诱变具有广谱性，即一次诱变能够获得多个材料同一位置多种不同程度变异及同一材料不同位置突变。是否利用辐射诱变的广谱特性，对如通禾899 这种在以往的辐射育种实践中被证明是好的受体亲本的材料进行高能重离子束重复辐射，这方面也需要今后做一些有益的尝试。

总之，高能重离子束辐射诱变育种技术与其它诱变方法（化学、60Co）和常规杂交育种相比，简单、快捷、高效，能创造新的材料。一旦辐射受体亲本选择正确，突变体丰富，有益突变多，一次辐射能培育出多个水稻品种，能够弥补杂交育种工作量大、周期长，“千个组合、万里挑一”的不足。