煤矸石复垦区玉米根际与非根际土壤细菌群落对覆土厚度的响应

张变华，靳东升，张 强，郜春花，李建华

(1.忻州师范学院，山西忻州 034000； 2.山西农业大学，山西太原 030031)

煤炭开采过程中排放的煤矸石约占原煤产量的15%～20%[1]。据不完全统计，目前我国煤矸石累积排放量已达38亿t，并以每年2亿t的增长量逐年增加[2]。堆积的煤矸石不仅占用了大量土地，而且对水体、土壤和大气也造成严重污染。采煤矿区通常采用煤矸石回填覆土的方式进行复垦[3-4]。Lubos等通过比较露天煤矿废弃地表层覆土与未覆土后的土壤特性变化，发现在采煤废弃地表层覆土后矿区土壤有机碳、腐殖质和有效磷含量显著增加，促进了复垦土壤的发育[5]。洪坚平等通过研究不同复垦措施对山西阳泉煤矸石山土壤培肥的影响，发现矸石上覆土并种植豆科牧草可显著改善土壤有机质，快速培肥土壤[6]。郭友红等的研究表明，覆土厚度会影响农作物的长势、外观和产量[7]。刘会平等的研究表明，煤矸石填埋覆土厚度差异会影响土壤生产力[8]。刘鑫尧等的研究表明，煤矿复垦地覆土厚度与小麦产量呈正相关[9]。黄凯的研究表明，覆土厚度会影响充填土壤表层含水量[10]。张轩等的研究表明，60 cm覆土厚度相较于40 cm有利于提高复垦土壤的保水保肥能力，可以增加大豆地下与地上生物量[11]。张轩研究发现，80 cm 和120 cm覆土厚度相较于40 cm的复垦土壤，容重、沙粒含量明显降低，气相比例增加，虽然覆土厚度对复垦土壤微生物数量、酶活性及土壤呼吸的影响没有明显规律，但80 cm和120 cm覆土厚度利于改善复垦土壤微生物群落功能多样性[12]。陈孝杨等的研究表明，煤矸石充填复垦时，覆土较薄(20～40 cm)会降低土壤呼吸速率，对温度敏感性较强，不利于生物活动；覆土较厚(>100 cm)会使有利于生物活动的积极因素消失[13]，且会浪费资源从而加大复垦成本[12]。因此，适宜的覆土厚度是矿区复垦成功的关键[14]。

土壤微生物多样性是表征土壤肥力水平高低的敏感性指标。然而，综上所述，当前利用现代高通量测序技术对不同覆土厚度下复垦土壤细菌群落结构及其多样性的研究鲜见报道。由于根际是土壤微生物与植物相互作用的重要场所[5]。所以本研究选择山西屯兰矿区复垦地为研究对象，分析不同覆土厚度下玉米根际与非根际土壤细菌群落组成及其多样性，以期为矿区生态恢复和重建技术提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验区位于山西省古交屯兰煤矸石复垦区，年平均气温约9.5 ℃，年平均降水量约460 mm。本试验设置3个覆土厚度，分别为40、80、120 cm。不同覆土厚度下的试验小区面积均为20 m2(4 m×5 m)。于2020年5月28日采用人工点播的方式种植玉米，施肥方式为人工撒施肥料，施肥种类为有机肥配施无机肥，施肥量为有机肥7 500 kg/hm2、无机肥600 kg/hm2，株距、行距分别为30、55 cm。

1.2 样品采集

于2020年7月9日(玉米花期)，在不同覆土厚度下(40、80、120 cm)的试验小区，进行根际与非根际土壤样品采集。

根际土壤：在各试验小区选择长势差不多的玉米3株，利用挖掘法和抖落法[15]进行采集，先抖落掉玉米根系大块土，然后将用毛刷轻轻刷下的0～2 mm 的根际土收集在无菌塑料袋中，密封后放入装有冰袋的保温箱内，带回实验室进行室内分析化验。

非根际土壤：利用土钻按照对角线法采集不同覆土厚度下玉米株间深度为0～20 cm的土壤样品，放入灭菌袋，密封后放入(4 ℃保温箱)带回室内进行化验。

根际与非根际土壤样品，每个处理3次重复。未能及时做微生物培养试验的土样放在-80 ℃冰箱冷冻保存。

1.3 试验方法与数据处理

高通量测序由上海派森诺生物科技有限公司对玉米根际与非根际土壤进行微生物组DNA提取、目标片段聚合酶链式反应(PCR)扩增、产物回收纯化、荧光定量等，使用MiSeq型测序仪测定玉米根际与非根际土壤中细菌 V3-V4扩增于序列变体区(amplicon sequence variants，ASV)序列单元。

土壤全氮含量采用半微量开氏法测定，有机质含量采用重铬酸钾氧化-外加热法测定；有效磷含量采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定；速效钾含量采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定；碱解氮含量利用碱解扩散法进行测定；pH值采用水土比为2.5 mL ∶1 g的方法测定。

利用Origin、Qiime与Canoco软件对土壤中细菌数据进行整理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同覆土厚度下复垦土壤细菌ASV分析

ASV指扩增子测序中按照100%相似水平下聚类形成的序列单元。由图1可知，不同覆土厚度下玉米根际与非根际土壤中细菌ASV数量范围为 1 133～3 862个。覆土厚度为80cm处理的复垦地玉米根际土壤中ASV数量最多。对于玉米根际土壤，细菌ASV数量从大到小为R80>R40>R120；对于非根际土壤，顺序则为S80>S120>S40。

2.2 不同覆土厚度下复垦土壤细菌门和属特征

从图2可以看出，不同覆土厚度下玉米根际与非根际细菌中相对丰度较高的前十种细菌门包括放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、厚壁菌门(Firmicutes)、Patescibacteria门、蓝藻门(Cyanobacteria)。放线菌门和变形菌门的相对丰度均大于10%，相对丰度范围分别为34.71%～63.61%和18.56%～32.03%，为该复垦区不同覆土厚度下的优势细菌门。同一覆土厚度下，玉米根际土壤放线菌门的相对丰度均高于非根际土壤，变形菌门的相对丰度均低于非根际土壤，80 cm厚度处理相较于40 cm和120 cm处理玉米根际放线菌门的相对丰度有所增加，根际变形菌门的相对丰度有所降低。而40 cm厚度处理相较于80 cm和 120 cm 处理非根际土壤中放线菌门的相对丰度有所降低；80 cm 厚度处理相较于40 cm和120 cm厚度处理非根际土壤中变形菌门的相对丰度有所增加。

从图3可以看出，不同覆土厚度下根际与非根际土壤中相对丰度较高的前20种细菌属中，相对丰度均大于1%的细菌属有溶杆菌属(Lysobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、类诺卡式属(Nocardioides)和67-14属；还发现同一覆土厚度下非根际土壤中溶杆菌属、分枝杆菌的相对丰度均高于根际土壤，类诺卡式属的相对丰度则表现为非根际土壤低于根际土壤。在根际土壤中，相较于40、120 cm厚度处理，80 cm厚度处理溶杆菌属、分枝杆菌的相对丰度有所降低，类诺卡式属的相对丰度有所提高；在非根际土壤中，80 cm厚度处理相较于40 cm和120 cm厚度处理67-14属的相对丰度有所增加。

总体来看，覆土厚度可以改变根际与非根际土壤中细菌门和属的相对丰度，根际与非根际土壤中的细菌群落有差异。

2.3 不同覆土厚度下复垦土壤中的细菌α多样性

微生物α多样性通常用Chao1、Shannon、Pielou和Simpson指数表征，它们分别表示微生物丰富度、物种多样性、均一度和优势度。

从图4可以看出，对于根际土壤而言，80 cm厚度下玉米根际土壤Chao1指数显著高于120 cm厚度处理，但与40 cm厚度处理差异不显著；80 cm厚度处理Shannon、Pielou和Simpson指数均最低，但与40 cm和120 cm厚度处理差异不显著。 对于非根际土壤而言，80 cm厚度下Chao1、Shannon、Pielou均显著高于40 cm厚度处理，但与120 cm厚度处理差异不显著。各覆土厚度处理间Simpson指数无显著差异。

从图4也可以看出，同一覆土厚度下，根际与非根际土壤间Simpson指数无显著差异。80 cm厚度下，非根际土壤Shannon和Pielou指数显著高于玉米根际土壤，40 cm和120 cm厚度下根际与非根际土壤间差异不显著。对于Chao1指数，80 cm和 120 cm 厚度下均表现为根际土壤低于非根际土壤，但120 cm厚度下差异显著；40 cm厚度下则表现为根际土壤显著高于非根际土壤。

总体来看，覆土厚度可以改变复垦土壤细菌多样性，80、120 cm的覆土厚度相较于40 cm有利于提高复垦区非根际土壤细菌多样性。

2.4 不同覆土厚度下复垦土壤细菌群落结构的β多样性

利用Origion软件对不同覆土厚度下玉米根际与非根际土壤细菌群落结构进行主坐标分析(Principal coordinates analysis，简称PCoA)。由图5可以看出，PCo1和PCo2分别解释24.7%和13.4%。PCoA1将玉米根际与非根际土壤细菌群落隔开，非根际土壤分布在第一、第四象限，根际土壤基本分布于第二、 第三象限。PCoA2将40 cm厚度与80、120 cm厚度分隔开，对于非根际土壤，80 cm和120 cm厚度分布于第一象限，40 cm分布于第四象限，说明80 cm与120 cm厚度下土壤细菌群落差异不大，但它们与40 cm厚度间差异较大。对于根际土壤而言，80 cm覆土厚度位于第三象限，但与 40 cm 和120 cm厚度的间距较近，所以不同覆土厚度间根际细菌群落差异不大。

2.5 玉米根际与非根际土壤细菌群落结构与土壤环境因子相关性的冗余分析(RDA)

利用Canoco软件对不同覆土厚度下玉米根际与非根际土壤中前20种细菌属与土壤中全氮含量、有机质(OM)含量、速效钾(AK)含量、有效磷(AP)含量、碱解氮含量和pH值进行了RDA分析。结果表明，不同覆土厚度下玉米根际与非根际土壤中细菌群落结构与根际与非根际土壤中速效钾含量、有机质含量显著相关，其中速效钾含量的贡献率最大，达58.2%，其次为有机质和有效磷，贡献率分别为13.4%和5.7%(表1)。同时，从图6也可以看出，不同覆土厚度下根际与非根际差异较大。对于非根际土壤而言，40 cm厚度处理与80、120 cm厚度处理间差异较大；而不同覆土厚度下根际土壤间差异不大。

表1 RDA前选择结果

3 讨论

3.1 覆土厚度影响玉米根际与非根际土壤细菌微生物群落结构

本研究结果表明，该复垦区各覆土厚度下玉米根际与非根际土壤中放线菌门和变形菌门的相对丰度最高，是该煤矸石填埋复垦区优势细菌门。该结果与李金融等报道的结果[16]类似。因为放线菌门、变形菌门均为适应环境能力强的细菌。变形菌门多为异养或者兼性营养细菌；放线菌门能降解大量不同种类的有机化合物，对有机物的矿化有着重要功能[16]，能在矿区恶劣环境中生存[17]。

许多研究表明，植物根际和非根际土壤中微生物群落有差异[18-21]。本研究表明，同一覆土厚度下，玉米根际土壤放线菌门、类诺卡式属的相对丰度均高于非根际土壤；玉米非根际变形菌门、溶杆菌属、分枝杆菌属的相对丰度均高于根际土壤。这是因为植物20%～50%的光合同化产物转移到地下部，大部分以有机和无机分泌物形式释放到根区[22]，能够促进或抑制某些特定类群的增殖和丰度的提高。本研究也发现，覆土厚度会改变根际与非根际细菌群落结构，如80 cm厚度相较于40、120 cm玉米根际放线菌门、类诺卡式属的相对丰度有所增加，根际变形菌门、溶杆菌属、分枝杆菌的相对丰度有所降低。原因是覆土厚度会影响复垦区作物根系的生长[8]。本研究表明，80 cm的覆土厚度或可促进玉米根系分泌有利于根际放线菌门、类诺卡式属生长的物质，为其提供充足的基质与能量，进而增加其相对丰度。

3.2 覆土厚度影响作物根际与非根际土壤细菌微生物多样性

覆土可以改变矿区土壤水分、结构及作物根系生长，适宜的覆土厚度在矿区植被恢复和生态重建中有重要的作用。众多研究表明，较高的微生物多样性对于增强生态系统和微生物功能的稳定性较好[23-24]，且作物根系活动会导致作物根际与非根际土壤间的微生物多样性产生明显差异[25-26]。Berg等研究发现，根际细菌群落的多样性普遍低于非根际土壤[27]。本研究也发现，80 cm厚度下非根际土壤细菌群落Shannon和Pielo-Eveness指数显著高于玉米根际土壤；80 cm覆土厚度下玉米根际土壤细菌丰富度指数(Chao1)均高于40 cm和120 cm厚度处理，且80 cm厚度下非根际土壤中物种多样性指数、均一度指数均显著高于40 cm厚度处理，但与120 cm厚度间无显著差异。β多样性分析表明，非根际土壤细菌群落结构在80 cm厚度处理与40、120 cm厚度处理差异显著。加之由于80 cm相较于120 cm的覆土厚度利于节约成本，所以覆土 80 cm 应是该煤矸石填埋复垦区较为适宜的覆土厚度，不仅可以增加复垦土壤细菌多样性，为玉米生长提供良好的土壤环境，而且对于维持煤矸石填埋复垦区生态系统功能有良好的作用。

3.3 各覆土厚度下作物根际与非根际土壤细菌群落与土壤养分关系

Wang等研究发现，土壤养分在根际与非根际微生物群落多样性中作用有差异，认为土壤养分中全氮含量、有效磷含量、速效钾含量和有机质含量与根际细菌群落多样性显著相关[28]。本研究表明，各覆土厚度下玉米根际与非根际土壤中细菌群落结构与土壤中速效钾含量、有机质含量显著相关。这是因为矿区复垦土壤由于本身具有有机质含量低、养分贫瘠的特征，土壤中细菌群落特征会因土壤性质不同而有差异[29]。

4 结论

本研究表明，放线菌门和变形菌门为该复垦区各覆土厚度下的玉米根际与非根际土壤中的优势细菌门，溶杆菌属、分枝杆菌属、类诺卡式属和67-14属为优势细菌属。覆土厚度可以改变玉米根际与非根际土壤中的细菌群落结构及其多样性。无论玉米根际还是非根际土壤，80 cm覆土厚度下土壤中ASV数量最多，且玉米根际细菌ASV数量均高于非根际。该覆土厚度不仅能够提高玉米根际放线菌门、类诺卡式属的相对丰度，增加非根际土壤中变形菌门、67-14属的相对丰度；而且可以增加复垦土壤中的细菌群落物种多样性和均一度指数，土壤中的速效钾、有效磷和有机质驱动其变化的主要养分因子。结合经济投入，认为覆土80 cm为该复垦区较为适宜的覆土厚度。