褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下藜麦生长及生理的影响

李平平，张永清，，张 萌，马星星，薛小娇，张文燕，王 茹，梁 萍，王 丹，赵 刚

(1.山西师范大学生命科学学院，山西太原 030000； 2.山西师范大学地理科学学院，山西太原 030000)

土壤盐渍化会引起土壤物理性质的恶化，直接危害作物生长甚至生存，导致农业综合产能下降，严重制约农业发展，造成大面积土壤资源难以利用[1]。山西省位于黄土高原东缘，耕地大多集中在一系列盆地之中，盆地有灌溉之利，是山西省重要的粮食生产基地[2]。但由于盆地中地形、水文、气候等天然因素及系统不健全，使得土壤盐渍化问题较为严重，造成农作物大幅度减产[3]。目前，常见的盐碱地的改良措施包括水利、物理、化学和生物改良措施等[4]。但由于盐碱地的土壤障碍因素繁杂，导致其改造困难且周期漫长[5]。前人研究表明，在众多措施中，改变(或选择)作物以适应环境，如通过引种、筛选和种植耐盐作物，采用化学调控措施如施用外源化合物处理种子以提高其抗盐碱性[6]以及躲盐巧种等，是改善和利用盐碱土耕地资源措施中最具生态效益和经济效益的方法[7]，往往可以起到事半功倍的效果。

藜麦(ChenopodiumquinoaWilld.)为一年生苋科藜亚科藜属双子叶植物。近年来，藜麦因其丰富全面的营养价值与良好的食疗功效受到越来越多追求健康饮食人们的青睐[8-9]。另外，因大多数藜麦品种具有较强的抗逆性，可在干旱、盐碱、低温、瘠薄等多种逆境中生长[10]而使得其在盐碱、干旱及冷凉区具有明显区位优势，有望成为这些地区脱贫致富的关键农作物。尽管近年来国内外诸多学者在探究藜麦营养价值、食品功能性及抗逆性上取得了一些重要进展，但有关如何进一步提高藜麦耐盐碱性的研究仍有待加强。

褪黑素(melatonin，MT)化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺。作为一种新兴植物生长调节物质，褪黑素被认为是天然抗氧化剂。已有研究表明，褪黑素能够通过提高非生物胁迫下植物中抗氧化酶活性和抗氧化剂含量，清除过量活性氧自由基和体内多种活性氧，缓解胁迫对膜系统造成的损害[11]，进而起到缓解逆境胁迫的效果，尤其是能显著缓解盐碱胁迫[12-14]、低温或高温胁迫[15-18]、干旱胁迫[19]等对植物造成的损害。但有关外源褪黑素调控藜麦耐盐碱性的相关研究鲜有报道。因此，本研究以不同耐盐碱性藜麦为试验材料，探索分析了褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下不同耐盐碱性藜麦植株的生长及生理特征的影响，旨在筛选出最适褪黑素浸种浓度，探究通过褪黑素来提高藜麦耐盐胁迫能力的生理机制，以期为藜麦生产过程中利用褪黑素来强化藜麦耐盐性和揭示褪黑素增强藜麦耐盐性机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用经抗性鉴定的2个耐盐碱能力不同的藜麦品种[20]：陇藜3号(盐碱敏感品种)和陇藜4号(耐盐碱品种)为供试品种。试验所用种子均由甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所魏玉明老师提供，褪黑素(分析纯)购自山西艾科实验室设备有限公司。

1.2 试验设计

试验设置了不同耐盐碱性藜麦品种(L3、L4)和褪黑素浓度(0.75、150、300 μmol/L)2个因素，共设置10个处理：L3CK(陇藜3号+正常土壤+蒸馏水)、L3MT0(陇藜3号+盐碱胁迫土壤+蒸馏水)、L3MT75(陇藜3号+盐碱胁迫土壤+75 μmol/L MT)、L3MT150(陇藜3号+盐碱胁迫土壤+150 μmol/L MT)、L3MT300(陇藜3号+盐碱胁迫土壤+300 μmol/L MT)、L4CK(陇藜4号+正常土壤+蒸馏水)、L4MT0(陇藜4号+盐碱胁迫土壤+蒸馏水)、L4MT75(陇藜4号+盐碱胁迫土壤+75 μmol/L MT)、L4MT150(陇藜4号+盐碱胁迫土壤+150 μmol/L MT)、L4MT300(陇藜4号+盐碱胁迫土壤+300 μmol/L MT)。采用随机设计，每处理重复8次，共计80盆。

混合盐碱胁迫条件的设计：试验选择2种中性盐 (NaCl、Na2SO4)和1种碱性盐(NaHCO3)，参照文献[3]以晋南地区中度盐碱地0～20 cm土壤全盐量以及硫酸盐氯化物草甸盐土的盐分组成为依据进行盐分配比，确定试验所需各盐碱比例(NaCl ∶Na2SO4∶NaHCO3质量比为5 ∶4 ∶1)，并按此盐碱比计算各种盐所需用量，分别称量后装入自封袋备用。以直径40 cm、高30 cm的黑色无孔营养钵作为试验用盆，进行藜麦盆栽试验。栽培基质为过筛风化土与细沙体积比为1 ∶1的混合物，混合均匀后装入营养钵，每钵装基质17 kg。每钵施入等量的氮、磷、钾肥作为肥底，1 kg基质用量分别为 0.15 g N、0.20 g P2O5、0.15 g K2O，NaCl、Na2SO4、NaHCO3以及氮、磷、钾肥与栽培基质搅拌均匀装入营养钵内。

试验在山西师范大学室外防雨棚内进行。选取健康饱满均匀的藜麦种子，用质量分数为3%的H2O2溶液消毒15 min，蒸馏水反复冲洗直至干净。之后将种子分别置于盛有不同浓度褪黑素溶液的烧杯中，浸种8 h，CK和MT0组以等量蒸馏水浸种。浸种完成后所有处理适时常规播种。试验期间采用称量法浇水，保持土壤水分在田间持水量的60%～75%。为防止自上而下灌水导致土壤施入盐分集中到盆底无法模拟现实盐碱地的土壤盐分分布，本研究在营养钵内放入聚氯乙烯(PVC)管作注水管，管下端斜切，插入用纱布包裹的石子中，以保证水分正常注入钵底，从而实现自下而上灌水，试验期间2种灌水方式交替进行。所有栽培管理措施中，除褪黑素处理不同外，其他条件均保持一致。4叶1心时期定苗，每钵留长势一致、均匀分布的藜麦苗5株。于显穗期测定藜麦相关指标。

1.3 测定项目与方法

用米尺测植株高度、用游标卡尺测其茎粗，从根茎结合部将地上部和根系分开，分别进行取样。取样期间进行完整的根系采集，采用Delta-T SCAN植物根系分析系统测定根系总长度、表面积、体积[21]。将地上部和根系样品放入烘箱，105 ℃下杀青 30 min，80 ℃ 下烘至恒质量，烘干后立即用电子天平分别称量并记录。取植株自上向下第2张新展开叶片，用手持SPAD值叶绿素仪测定叶绿素含量，用叶面积仪测定其叶面积。参照高俊凤的方法[22]测定根系活力；参照李合生的方法[23]测定叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性；采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法(ELISA)，用酶标仪 (Rayto RT-6100型)和谷胱甘肽还原酶(GR)的ELISA检测试剂盒测定谷胱甘肽还原酶(GR)活性水平[24]。

采用Microsoft Excel 2010 软件进行数据整理，利用SPSS 22.0 软件进行方差分析，并用Duncan’s法进行多重比较。采用Origin 2018进行绘图。

2 结果与分析

2.1 褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下藜麦生长的影响

2.1.1 褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下藜麦地上部生长的影响 由表1可知，混合盐碱胁迫对2个品种藜麦地上部(MT0)的生长均有显著影响(P<0.05)，表现为盐碱敏感品种L3和耐盐碱品种L4的株高、茎粗和叶面积与 CK相比分别降低了30.00%、23.99%、30.56%和38.73%、5.66%、12.49%。混合盐碱胁迫下，对于耐盐碱品种L4而言，其株高、茎粗和叶面积均呈现随着褪黑素浓度的增大先升后降的趋势，且各指标均在MT150处理达到峰值，与MT0相比各指标的增幅分别为25.13%、17.60%、22.32%，超过最适褪黑素浓度各指标开始下降。对于盐碱敏感品种L3而言，其株高、茎粗和叶面积随褪黑素浓度的增大而逐渐升高，于MT300处理达到最大值，分别比MT0高52.70%、73.73%、48.18%。以上结果表明，褪黑素浸种可以缓解藜麦在混合盐碱条件下的受胁迫程度，使植株地上部营养器官更好生长，但相同浓度褪黑素对2个品种的缓解效果不同。

表1 褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下藜麦地上部的影响

2.1.2 褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下藜麦根系生长的影响 由表2可知，盐碱胁迫下L3的总根长度、根系体积和根系表面积均表现为MT300>MT150> MT75>MT0，与CK相比，混合盐碱胁迫处理诱导L3的上述3个指标(MT0)，分别显著降低30.10%、44.35%、42.50%(P<0.05)。各褪黑素处理中 300 μmol/L浓度下L3的总根长度、根系体积、根系表面积显著增加分别为MT0的1.2、1.8、1.7倍。耐盐碱品种L4的各处理中，MT0与CK相比，总根长度、根系体积、根系表面积分别显著降低29.12%、28.70%、12.54%(P<0.05)，胁迫处理中藜麦根系上述3项指标均表现为MT150>MT300>MT75>MT0，其中 150 μmol/L褪黑素浸种后L4的总根长度、根系体积、根系表面积显著增加分别为MT0的1.4、1.5、1.2倍。由此可见，混合盐碱胁迫对不同耐盐碱性藜麦根系生长的胁迫程度不同，褪黑素可以通过增加根系的总根长、体积和表面积，增大根系吸收面积以保证在土壤中吸收更多水分和营养物质，从而维持藜麦在盐碱胁迫环境下的正常生长。

由图1可知，混合盐碱胁迫下，2个品种藜麦(MT0)的侧根数均显著低于CK，分别下降了39.16%、37.6%。L4的侧根数呈随着褪黑素浓度的增大呈先升后降的变化趋势，在MT150处理时达到峰值；各浓度褪黑素处理与MT0相比均有所增加，增幅分别为12.82%、55.13%、39.74%。L3的侧根数随褪黑素浓度的增大呈逐渐升高的趋势，与MT0相比，MT75、MT150、MT300增幅分别为9.59%、60.27%、65.75%。2个品种藜麦的MT150、MT300处理与MT0间均达到显著性差异(P<0.05)。由此可见，褪黑素能刺激混合盐碱胁迫下藜麦侧根的生长，增大根系的吸收面积，吸收更多养分以缓解盐碱胁迫带来的危害。

表2 褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下藜麦根系生长的影响

2.1.3 褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下藜麦植株干质量的影响 由图2可知，与CK相比，混合盐碱胁迫显著降低了2个品种藜麦(MT0)的地上部及根系干质量，降幅分别为48.72%、33.70%(L3)和38.46%、22.02%(L4)，盐碱敏感品种的降幅大于耐盐碱品种，并且混合盐碱胁迫对地上部干质量积累的影响大于根系。混合盐碱胁迫下，L4的地上部及根系干质量随着褪黑素浓度的增大呈现出先升后降的变化趋势，且二者均在MT150处理达到峰值，与MT0相比增幅达到70.24%、24.83%，MT0与MT150、MT300处理间均存在显著性差异。L3则呈现出随褪黑素浓度的增大地上部及根系干质量逐渐升高的变化趋势，且均在MT300达到最大值，与MT0相比增幅分别为121.05%、37.22%，各褪黑素处理均与MT0处理存在显著差异(MT75地上部干质量除外)。由此可见，褪黑素浸种处理对于缓解混合盐碱胁迫条件下藜麦干物质的积累减少有明显效果，其中对地上部的缓解作用要大于对根系的缓解作用。

2.2 褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下藜麦生理的影响

2.2.1 褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下藜麦叶片抗氧化酶活性的影响 由图3可知，与CK相比，混合盐碱胁迫导致2个品种藜麦叶片(MT0)的SOD、POD和GR活性均显著下降(P<0.05)，这可能是由于盐碱胁迫时间较长，藜麦叶片内的活性氧积累过多，超出藜麦自身抗氧化酶类系统的清除范围，导致该系统的清除活性氧能力减弱或丧失。各褪黑素处理可不同程度提高藜麦叶片的 SOD、POD和GR活性。L3的3种抗氧化物酶活性均表现为 300 μmol/L 处理的酶活性最高，150 μmol/L浓度次之，75 μmol/L浓度处理最低；SOD、POD、GR活性和MT0相比，最大增幅分别可达54.15%、48.27%和126.95%。L4品种的SOD、POD和GR活性则是以150 μmol/L处理的最高，300 μmol/L次之，75 μmol/L 浓度处理最低；与MT0相比SOD、POD增幅达到50.34%和38.94%，GR活性在150 μmol/L浸种浓度下达到峰值，为2.92 U/g。以上结果表明，褪黑素浸种可以有效提高混合盐碱胁迫下2个品种藜麦叶片的SOD、 POD以及GR活性，增强藜麦叶片活性氧的代谢能力，清除自由基和活性氧，缓解氧化伤害以增强藜麦抗盐碱性，更加适应不良生境。

2.2.2 褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下藜麦根系活力和叶片叶绿素含量的影响 由图4-a可知，混合盐碱胁迫显著降低了2个品种藜麦的根系活力，与CK相比MT0的降幅分别为37.33%(L3)、27.30%(L4)，L3降幅大于L4。与盐碱胁迫处理相比，褪黑素浸种处理显著提高了藜麦的根系活力，表现为L3的根系活力随褪黑素浓度的增大呈现出逐渐上升的变化趋势，在MT300处理达到峰值，与MT0相比增幅为60.14%，各褪黑素处理间差异显著。L4的根系活力则呈现出先升后降的变化趋势，在MT150处理达到最大值，相对于MT0其根系活力升高了32.79%，各褪黑素处理间差异显著。由此可见，褪黑素浸种可以有效提高混合盐碱胁迫下藜麦根系活力，促进根系吸收营养物质及水分以增强其抗盐碱性。

由图4-b可知，混合盐碱胁迫显著影响了2个品种藜麦叶片的叶绿素含量，与CK相比，L3和L4 MT0的叶绿素含量分别显著降低了15.72%和14.54%。经不同浓度褪黑素浸种处理后，盐碱敏感品种L3的叶绿素含量随褪黑色素浓度的增大而上升，在褪黑素浓度为300 μmol/L时达到最大值，与MT0处理相比，叶绿素含量增加18.72%，MT0与MT75处理无显著差异，与MT150和MT300处理差异显著。耐盐碱品种L4叶绿素含量则是随褪黑素浓度升高呈现出先升后降的变化趋势，与MT0相比，当褪黑素浓度为150 μmol/L时叶绿素含量增加12.36%，而当褪黑素浓度继续升高时叶绿素含量降低，MT0与MT75处理无显著差异，与MT150和MT300处理差异显著。以上结果表明，混合盐碱胁迫使藜麦叶片的叶绿素含量降低，而褪黑素的施用在一定程度上提高了混合盐碱胁迫下叶绿素的含量，缓解了由混合盐碱胁迫引起的光合抑制。不同浓度褪黑素对于不同耐盐碱性藜麦叶片叶绿素降解的缓解效果不同。

3 讨论与结论

前人研究表明，单一中性盐胁迫已对植物生长甚至生存构成重大威胁，混合盐碱胁迫生境下，植物更是遭受远高于单一中性盐胁迫的不可逆损伤[29]。褪黑素既可以作为一种信号分子，又可作为一种抗氧化分子[30]，褪黑素的作用效果与剂量有直接关系，最适浓度褪黑素可抵抗环境胁迫，但植物种类不同，其最适浓度也不同[31]。200 μmol/L褪黑素处理能促进复合盐碱胁迫和碱性盐胁迫下越橘的生长，增加叶片光合色素含量，提高其光合能力，同时能通过增强叶片结构增强其耐盐碱性[32]。以 10 μmol/L 褪黑素浸种棉花幼苗后，其对盐胁迫环境的适应性有所提高[33]。本研究试验条件下，对同一种植物的不同抗性品种而言，其最适褪黑素浸种浓度也有所不同，盐碱敏感品种L3的最适褪黑素浸种浓度为300 μmol/L、耐盐碱品种L4的最适褪黑素浸种浓度为150 μmol/L。

生长状况是作物对于盐碱胁迫的综合反映，也是作物抗盐碱性最优的评价指标。盐碱胁迫会抑制作物株高和茎粗，对营养生长有明显抑制作用[34]。本研究中，混合盐碱胁迫导致2个品种藜麦的株高、茎粗、叶面积及生物量均显著下降，经褪黑素浸种处理的2个不同耐盐碱性品种藜麦在混合盐碱胁迫下上述4个指标的下降趋势均得到有效缓解，这与李阳等报道外源褪黑素有效促进盐胁迫下棉花幼苗株高生长的变化趋势[35]基本一致；与张娜等报道褪黑素促进狼尾草干物质积累结论[36]相类似，表明褪黑素浸种可能通过促进逆境下藜麦地上部的生长，以积累更多有机物进而维持藜麦正常的生长发育。

作物根系形态结构能直接反映出作物生长发育水平及作物对土壤水分和矿质元素的吸收能力[37]。在胁迫条件下，根系往往是直接或者首要的受害部位，其根长、分枝及根毛的多少都会使其对土壤水分及养分吸收能力的强弱造成直接影响，较长的根长、较强的根系活力、较大的根表面积和根体积都有助于作物吸收利用水分和养分[38-39]。本研究中，混合盐碱胁迫下，2个品种藜麦根系的侧根数、总根长度、表面积、体积以及根系活力都显著降低，褪黑素浸种处理则明显提高了上述根系指标，其中300 μmol/L的褪黑素对陇藜3号缓解效果最好，150 μmol/L褪黑素对陇藜4号缓解效果最好。褪黑素能够诱导根系生长受生长素调节过程的调控，影响根系对水分的吸收，启动细胞壁不可修复的延伸[31]。另外，褪黑素浸种促进了藜麦侧根数目的增加，是由于5HT作为褪黑素合成前体，并非增强根系侧根的萌发效应，而是与 IAA 形成了拮抗作用，抑制根系的顶端优势，增加了侧根数目[40]。本研究结果与聂必林等报道褪黑素有效促进复合盐碱胁迫下黑果枸杞幼苗芽长、根长生长及侧根数目增加的变化趋势[41]相似，与付晴晴等报道的褪黑素能够提高NaHCO3胁迫下葡萄根系活力的研究结果[42]一致。表明褪黑素可能通过促进根系的形态发育，增大其吸收面积，提高根系活力，增强根系对营养物质的吸收、转运、积累和利用，从而保证作物在盐碱胁迫下正常生长。

叶绿素是植物进行光合作用的功能色素，其含量多少会影响植物的光合生理。盐胁迫会影响植物叶片内叶绿素的代谢过程，导致叶绿素的合成量减少，加快叶绿素的降解[43]。本研究中混合盐碱胁迫导致2个品种藜麦叶片的叶绿素含量都显著降低，褪黑素浸种处理不同程度的增加了2个品种藜麦叶片的叶绿素含量，这与盐胁迫条件下施用褪黑素抑制番茄叶绿素降解，维持其后期叶绿素含量的研究结果[44]相似。因此，适宜浓度褪黑素浸种可以有效缓解盐碱胁迫下叶片叶绿素的降解，有助于增强作物的光合作用，提高对逆境的适应性。

逆境常迫使植物体内产生过多的活性氧，致使自由基积累过量、加剧膜脂过氧化、细胞内蛋白质与重要酶类失活分解等一系列不良反应的发生，危及植物的生长发育[43，45-47]。抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环是植物体内清除活性氧(ROS)的重要途径。谷胱甘肽还原酶是此途径中的关键酶，催化氧化态的谷胱甘肽(GSSG)还原生成还原态的谷胱甘肽(GSH)维持植物体内的GSH含量和GSH库的氧化还原状态并清除ROS。GR对植物体内ROS的清除、维持GSH的含量、保持细胞的谷胱甘肽库的氧化还原状态(GSSG/GSH)作用极大[48]。SOD作为膜保护的首道防线，可以清除超氧阴离子，转变为氧化能力极强的羟自由基[49]。本研究发现，混合盐碱胁迫下两品种藜麦叶片的SOD、POD、GR活性均降低，这与赵颖等随着胁迫程度的增加抗氧化酶活性显著降低的结论[7，26]相似；这可能是由于盐碱胁迫时间较长，致使藜麦体内盐含量过度积累，已超过藜麦自身抗氧化系统的清除阈值，导致抗氧化物酶活性降低，说明藜麦清除活性氧和自由基的能力减弱，保水能力下降。外源褪黑素能提高植物的抗氧化酶活性，清除植物体内活性氧[50]。本研究发现，除褪黑素浓度为75 μmol/L时，2个品种藜麦的SOD活性与盐碱单独胁迫处理差异不大，其他褪黑素处理均可显著提高混合盐碱胁迫下2个品种藜麦的SOD、POD、GR活性。这说明外源褪黑素可能参与混合盐碱胁迫下藜麦抗氧化酶系统清除活性氧的调控，增强植株对盐碱伤害的防御能力。

混合盐碱胁迫抑制了2个品种藜麦的生长和生理过程。本研究中，混合盐碱胁迫对盐碱敏感品种陇藜3号藜麦的生长及生理的抑制作用强于耐盐碱品种陇藜4号；褪黑素浸种对混合盐碱胁迫下盐碱敏感品种陇藜3号的缓解效果要优于耐盐碱品种陇藜4号。褪黑素浸种可通过促进地上部和根系的形态生长、刺激侧根发育、减少叶绿素降解、增加地上部和根系的干物质积累、提高根系活力、提高SOD、POD、GR等抗氧化酶活性，从而缓解混合盐碱对生长和生理的抑制，进一步增强藜麦的耐盐碱能力。在本试验条件下，300 μmol/L褪黑素浸种对盐碱敏感品种陇藜3 号耐盐碱性的提高效果最佳，150 μmol/L 褪黑素浸种对耐盐碱品种陇藜4 号耐盐碱性的提高效果最佳。