不同FSH处理方法对多浪羊FSH、LH、E2和P4激素水平及发情的影响

牛志刚，吕松杰，丁煜恭，王新海，司衣提·克热木，史洪才*

(1.新疆畜牧科学院生物技术研究所，新疆乌鲁木齐 830000；2.新疆五征绿色农业发展有限公司，新疆麦盖提844600；3.新疆喀什地区畜牧工作站，新疆喀什844000)

多浪羊是新疆喀什地区主要的绵羊品种，具有体型大、生长速度快、肉产量高、屠宰性能良好等特点。多浪羊可以全年舍饲，能适应新疆南疆地区夏季干燥炎热的环境，抗病力强，耐粗饲，能四季发情，且具有早熟性，是新疆优良的地方品种[1-3]。促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)能促进卵巢卵泡的生长、雌激素合成和分泌，促进卵泡颗粒细胞的增生和刺激卵泡细胞上促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)受体分化，其分泌方式受到下丘脑和性腺激素的调节，为脉冲式分泌。FSH控制颗粒细胞的发育、生长、成熟和类固醇生成，并在配子产生中发挥关键作用[4]。在发情周期的适宜时间给予适量的外源FSH[5]，可以有效地增加卵巢的排卵。FSH在绵羊生产上是常见的促超数排卵药物。多浪羊一般一胎产一只羔羊，平均产羔率约为107%，繁殖率较低，制约规模化养殖场的经济效益。利用外源激素对多浪羊实施同期发情处理和高效繁殖，可以提高繁殖效率，降低生产成本，增加养殖效益。

前人研究表明，孕酮+PMSG+PG的同期发情方法，可以达到很好的发情效果；较小剂量的FSH可以刺激少量卵泡同时发育排卵，产较多数量的羔羊。FSH多用于绵羊超数排卵，而利用FSH不同注射方式提高多浪羊的繁殖效率的相关报道较少。该研究以多浪羊为试验羊，在同期发情处理过程中注射150 IU的FSH，观察不同的注射方法对激素水平及发情的影响。为进一步提高多浪羊繁殖效率提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药品和器材。羊用孕酮海绵栓，新西兰 Inter Greaulane 公司生产；注射用促卵泡素(规格为500 IU/支)、孕马血清促性腺激素(规格为1 000 IU/支)、氯前列醇钠(规格为0.2 mg/支)均由宁波市三生药业有限公司生产。多功能酶标仪；美国Thereto Scientific公司；(FSH、LH、E2、P4)ELISA分析测定试剂盒；购自Groundwork Biotechnology Diagnosticate公司；生理盐水、乙醇、碘酒、高锰酸钾粉、青霉素、链霉素、假阴道、集精杯、开膣器、输精枪、显微镜、恒温水浴锅等均为国产。

1.1.2试验羊。 2020年5月在新疆五征绿色农业发展有限公司开展试验。母羊为2岁左右(172只)；种公羊为2岁以上，性欲旺盛，体型、外貌良好的成年公羊2只；试情羊选用有配种史、性欲旺盛的公羊5只。

1.2 方法

1.2.1试验羊分组与同期发情处理。采用单因素设计，选经过B超诊断未怀孕的试验羊，设为A、B、C 3个试验组和1个对照组D，在阴道中埋置1个孕酮海绵栓当天记为第 0 天，第9天A、B、C组按不同的FSH注射方法进行处理。A组10：00一次性注射FSH 150 IU；B组10：00注射100 IU FSH，8 h后再注射50 IU FSH；C组10：00注射75 IU FSH，8 h后再注射75 IU FSH；D对照组不注射FSH。4组第11天10：00撤栓时，肌肉分别注射PG 1 mL和PMSG 330 IU。

1.2.2发情鉴定。用试情公羊进行试情。在08：00和20：00，将试情公羊放到母羊圈各试情1次，以母羊站立不动并接受爬跨为发情标准，连续试情3 d，在72 h内发情视为同期处理有效，记录每只羊从撤栓到发情的时间间隔。

1.2.3采精和人工授精。

(1)用假阴道法进行采精。种公羊精液采出后，先通过肉眼观察，为乳白有“云吞”状的，在400×显微镜下对精液样品进行观察，活率在0.8以上，密度达到“密”级，无异常气味，色泽乳白的精液可用于人工输精。

(2)精液稀释配制。称取葡萄糖 3 g、柠檬酸钠 1.4 g，分别加入10万IU青霉素和链霉素，溶解于100 mL灭菌水中，用0.22 μm的滤膜过滤。

(3)精液稀释。将稀释液和精液降至室温。稀释时根据所需输精量，先进行等倍稀释，再加大稀释倍数，该试验稀释倍数为4倍。

1.2.4人工授精。使用阴道开张器输精，对有发情表现的母羊于发情后的12和24 h进行2次人工授精，使用开张器，将输精器插入子宫颈口内0.5～1.0 cm输入鲜精液0.1 mL。

1.2.5血样采集。挑选发情的多浪羊母羊98只，其中A组25只，B组25只，C组25只，D组23只，每只母羊在注射FSH前、撤栓时、发情0 h和发情12 h 颈静脉采集血样 3 mL，室温下静置5～6 h，3 000 r/min 离心 15～20 min，分离上层血清移入1.5 mL 离心管中，放入-20 ℃储存。

1.2.6激素测定。试验母羊血清采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定E2、FSH、LH和P4的浓度。根据ELISA试剂盒操作步骤测定，测定血清中 E2、FSH、LH和P4的含量，并以450 nm OD值为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线，计算出数值。

1.2.7数据统计分析。应用 SPSS 20.0(SPSS、Inc、Chicago、IL、USA)对激素水平、发情率数据进行卡方检验。

2 结果与分析

2.1 FSH不同处理方法对同期发情的影响统计4个试验组4个时间点的发情母羊数，并计算撤栓后12～72 h总体的同期发情率，结果见表 1。

表1 FSH不同处理方法对多浪羊同期发情的影响

由表1可知，A、B、C组注射FSH后的发情率分别为77.78%、80.65%、87.50%，D对照组发情率为80.36%，统计分析显示，4个组之间发情率差异不显著(P>0.05)；但C组发情率高于其他组。

2.2 FSH不同处理方法对外周血液中生殖激素的影响

2.2.1不同FSH处理方法多浪羊血清中FSH浓度的比较。由表2可知，在FSH处理前、撤栓前、发情0 h和发情12 h时，各试验组之间血清中FSH的浓度差异不显著(P>0.05)；B、C、D组FSH浓度在发情0 h都出现了峰值。

表2 不同FSH处理方法多浪羊血清中FSH浓度的比较

2.2.2不同FSH处理方法多浪羊血清中E2浓度的比较。

由表3可知，在FSH处理前各试验组之间血液中E2的浓度没有显著差异，在撤栓前B、C组显著高于A、D组，在发情0 h时，B、C组极显著高于A、D组，同时D组极显著高于A组(P<0.01)，在发情12 h时，B、C、D组E2浓度显著高于A组(P<0.05)。

表3 不同FSH处理方法多浪羊血清中E2浓度的比较

2.2.3不同FSH处理方法多浪羊血清中LH浓度的比较。由表4可知，FSH处理前和发情12 h时，各试验组之间血液中LH的浓度没有差异，撤栓前D组显著高于A、B、C组(P<0.05)，在发情0 h时，B组显著高于A、C、D组(P<0.05)。

表4 不同FSH处理方法多浪羊血清中LH浓度的比较

2.2.4不同FSH处理方法多浪羊血清中P4浓度的比较。由表5可知，在FSH处理前、撤栓前、发情0 h和发情12 h时，各试验组之间血液中P4的浓度差异不显著；B、C、D组的P4浓度峰值都出现在发情0 h时。

表5 不同FSH处理方法多浪羊血清中P4浓度的比较

3 讨论

3.1 FSH不同处理方法对外周血液中生殖激素的影响FSH作用靶细胞是卵泡颗粒细胞，FSH使其增生，同时激活FSH受体细胞导致雄激素的合成，而雄激素是雌激素合成的重要前置物质，因而FSH能够提高雌激素的浓度。雌激素与FSH协同作用一方面增加颗粒细胞中LH受体的分化，另一方面又促进颗粒细胞对雌激素的合成，形成一种良性循环。一般自然条件下绵羊发情是由于血清中E2浓度升高、P4浓度降低引起。

在卵泡周期募集期间，一群小卵泡对促性腺激素变得敏感并依赖于促性腺激素继续生长发育[6]。引起卵泡周期募集的主要激素是FSH，发情周期中卵泡波的数量与FSH峰值的数量完全一致，这说明FSH峰是卵泡波出现的先决条件，用抑制素降低FSH的浓度，可以阻碍卵泡募集并推迟下个卵泡波的出现[7]。更多的卵泡同时发育需要人为地提高FSH浓度，虽然也需要基础水平的LH，但LH脉冲在募集中没有作用[8]。张振汉等[9]在滩羊试验中，对产单、双羔的母羊进行分组，将LH、P4和E2进行分析比较，双羔组母羊在生殖周期中LH、P4和E2均显著高于单羔组，其中E2在发情当天处于高水平，随后下降，这与该试验B、C、D组结果一致；P4在发情当天开始有所上升，与该试验得出的在发情当天上升后随之下降有所不同；LH双羔组峰值出现在发情当天，且极显著高于单羔组，与该试验结果一致。常璐等[10]关于多浪羊同期发情试验的数据显示，E2在发情当天出现峰值，与该试验结果一致；P4、FSH和LH峰值出现在发情后12 h，与该试验结果略有差异。

通过试验结果可以看到，在使用FSH处理多浪羊之前采集的血清中FSH、E2、LH和P4的浓度在各试验组之间差异不显著，而E2在发情0 h时，B和C组极显著高于A、D组(P<0.01)，D组极显著高于A组。试验除了FSH的处理方法不一样，其他处理方式相同，试验组之间出现差异，说明注射的150 IU FSH对多浪羊E2浓度在发情0 h时有影响，但在4个时间点都未观察到FSH的浓度在试验组与对照组之间有显著差异，只在撤栓时A组高于其他3组，这与FSH的半衰期短有关，说明FSH不是直接对E2产生影响，而是作用于某一中间受体，可能是卵泡颗粒细胞，FSH使其增生，在PMSG和PG共同的作用下，造成B、C组与A、D组在发情0 h 时E2浓度的显著差异。

A组与B、C、D组的E2和LH浓度相比，在一次性注射150 IU FSH后一直处在较低水平，可能是造成了负反馈调节，也可能是激素的峰值提前或后移未被检测到。

3.2 生殖激素水平对发情率的影响将发情率和发情0 h时FSH、E2、LH和P4的浓度进行分析比较发现，E2在发情0 h时，B、C组极显著高于A、D组，D组极显著高于A组；LH在发情0 h，B组显著高于A、C、D组；A、B、C组注射FSH后的发情率分别为77.78%、80.65%、87.50%，对照组D组发情率为80.36%，统计分析显示，4个组之间发情率差异不显著(P>0.05)，但C组发情率高于其他组。B、C组的E2浓度相近，但是发情率C组高于B组，发情后C组的LH和P4的浓度要低于B组，可能是LH和P4参与了发情的催动，抑制了卵泡波的持续发生。

4 结论

外源生殖激素FSH的注射会对血液中 E2和LH的浓度造成影响，且发情0 h时血液中E2的浓度与发情率呈正相关。在发情0 h时出现A、B、C、D组的FSH峰值以及B、C、D组的LH、E2峰值，FSH和LH峰值的出现，为排卵前现象。一次性注射150 IU FSH可能会造成发情前、发情时、发情后的 E2和LH分泌的抑制，从而影响发情，考虑在以后试验中单次FSH注射剂量不超过150 IU。75 IU+75 IU平均注射法对发情率有较好的作用；100 IU+50 IU递减注射法，在发情0 h 可以明显提高血液中E2和LH的浓度。