分析技术在中药产地溯源及真伪鉴别中的应用研究进展

胡翔宇，郄梦洁，赵珊珊，王明林，张九凯，赵 燕*

(1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271018；3.中国检验检疫科学研究院，北京 100176)

中药广泛应用于我国医药行业，中药学是我国特有的与人文充分融合的医学科学，对我国医药行业的发展有着不可替代的深远意义[1]。据统计，我国现有中药资源品种约12 800种，常用中药600余种，源自718种不同的植物、动物、矿物质和人工化合物。近年来，中药已实现了超过300种中药人工种养。随着环境形势日益严峻和供需矛盾突出，同时因生产条件受限、监管体系不健全，中药的质量安全问题越来越引起广泛重视，实施中药产地溯源管理已经成为当前中药质量提升的重要举措，其中分析技术在中药产地溯源中具有重要作用，为中药产地溯源和真伪鉴别提供一定的技术支持[2]。

1 研究进展

1.1 稳定同位素技术稳定同位素技术的基本原理是同位自然分馏效应，这是由于不同地区的大气、土壤、水等同位素组成的差异，导致药材中同位素组成也有差异，这种差异可以用于区分其可能的地理来源。稳定同位素技术能通过对稳定同位素比值的变化反应环境因子对药材的综合影响，其准确率和重复性都很高；而且其成本正随着同位素质谱仪普及和测定效率的提高而下降，与传统人工鉴别相比，更具科学解释性及更低的成本[3]。

黄志勇等[4]建立了铅同位素比值测量方法，利用不同产地丹参的铅稳定同位素比值不同判断丹参产地，研究结果表明不同地区来源的丹参铅同位素比值有显著差异。尽管铅同位素已广泛应用于环境监测和铅污染来源解析的研究[5]。但是由于人为铅污染的影响和仪器分辨率不够精确，对铅同位素差别很小的样品，仅靠铅同位素比值分布鉴别其产地仍有困难，如峨眉山和新疆产的丹参208Pb/206Pb差别极小，需要结合其他手段进行进一步区分。

Choi等[6]曾试图利用锶稳定同位素对产自中国和韩国的人参进行区分，研究发现韩国所产人参的87Sr/86Sr均明显高于中国样品，可以对2个国家的人参样品进行区分。但是Rosner[7]在后续发表的文章中指出，该研究的前处理过程和后续的计算方法存在问题，导致中国样品87Sr/86Sr低于0.702(自然下限)，而根据Sr的初始同位素组成(BABI)和87Rb 放射性衰变计算，天然物质中87Sr/86Sr不可能低于0.702。可见锶同位素虽然是判别产地信息的良好指标，但在使用过程中一定要标准化前处理过程和误差校正，使结果符合标准。

Horacek等[8]也通过测定样品的碳、氮、氢同位素对中国和韩国的人参进行了区分，由于气候条件、水的可利用程度以及耕作措施等的差别，中韩两国出产的人参δD值存在明显的差异[6]。

Maggi等[9]利用2种不同方法对来自希腊马其顿地区、伊朗呼罗珊省、意大利撒丁岛、西班牙卡斯蒂利亚4个地区的28个藏红花样品进行了产地溯源。利用碳、氮和氢3种元素的稳定同位素进行产地溯源，准确率达到100%。

1.2 DNA条形码技术DNA条形码技术是通过一段标准的DNA序列进行生物物种鉴定的方法，具有通用性强、鉴定结果可靠、重复性良好等特点。在中药鉴定领域DNA条形码技术以其准确、通用、客观的特点在中药产地溯源关键环节发挥作用。在中药销售过程中，参与构建中药产地溯源体系，跟踪中药生产全过程，保障消费者权益，有助于中药监督管理[10]。

刘珊珊等[11]使用组织研磨仪将泽泻叶片样品破碎至粉状，提取泽泻基因组DNA。以泽泻样品的DNA进行筛选，获得引物4对，取各PCR产物电泳，选取单一的PCR产物、条带清晰的进行双向测序，通过对3个主产区8个种植区域的39份泽泻叶片样品的DNA 条形码检测，明确10个广西泽泻样本和16个四川泽泻样本的IST2序列完全一致，均为T碱基，表明2者可能为同一生物种，然而13个福建泽泻样本均为A碱基。

中药红曲是红曲霉的菌丝体寄生在粳米上而形成的红曲米，具有降脂、降压、降糖和抑制肿瘤生长等重要作用。宓鹤鸣等[12]运用随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)分析技术，将7种红曲霉属标准菌株及同属的1种土曲霉对照株共8株进行PCR扩增电泳，得到DNA条带，结果显示7种红曲霉属种间的相似率为42.1%～86.5%，表明红曲霉属真菌在种间的DNA扩增产物多态性非常明显，红曲霉与土曲霉的相似率为19.0%～30.5%，远远低于红曲霉种间的相似率。结果表明，基于基因组DNA基础之上的形态分类学与分子系统学具有良好的一致性，2者之间的遗传距离能通过RAPD扩增产物指纹谱较好地反映，具有较强的鉴别能力，结果与经典分类具有很大的吻合度，对某些分类学混乱和争议能做出更为准确自然地处理。

Zhong等[13]开发了一种结合了DNA条形码和高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)的方法，以确定5种贝母的物种可追溯性。基于DNA条形码，根据其遗传距离、识别效率、种间和种内变异，识别验证植物物种。结果表明，DNA条形码数据通过ITS和ITS2成功鉴定了5种贝母，具有区分贝母物种起源的能力。ITS2可用作贝母物种的潜在有用的DNA条码。另外，通过HPLC结合化学鉴定方法鉴定有效的化学成分以对贝母进行分类。

Duan等[14]应用DNA条形码技术，以区分重楼假根茎。选择ITS2条形码进行高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)分析，分离了所测试草药的DNA，并生成了它们的熔解曲线。结果表明，ITS2分子区域结合HRM分析可以有效地区分9种草药，包括重楼的2个正宗起源及其7个常见的掺假物。因此得出结论，DNA条形码与HRM分析相结合是一种准确、可靠、快速的工具，有助于对重楼药材进行质量控制。

目前，市场流通的天山堇菜药材基原不清，形态各异，各执一词，难辨真伪，这严重影响相关药品质量控制和应用。准确的基原鉴定是保障药材质量的根本，樊丛照等[15]通过分析18份不同来源的天山堇菜的DNA条形码ITS2序列发现，正品药材天山堇菜仅占44.4%，从而得出结论：天山堇菜用药安全存在很大的隐患，其同属数种植物作为伪品流入市场，它们是否与天山堇菜具有相同的功效，还需要结合化学成分和药理作用进行深入研究。

DNA条形码在中药基原物种鉴定、中药产地溯源系统研究中应用广泛，与此同时，DNA条形码在中药资源评价、保护和可持续利用中具有重要地位和作用，为中药DNA条形码研究提供新的思路[16]。

1.3 光谱技术近年来，光谱技术如近红外光谱、荧光光谱在中药鉴定中的应用逐渐增多。近红外光谱技术可以从样本中无损提取出分析信息，可应用于多种中药的真伪鉴别、次品的掺入量预测、中药品种的聚类分析，并能够快速有效地对中药整体质量进行评价与鉴定，但用于含量较小的组分分析时偏差较大[17]；荧光光谱法则具有良好的灵敏度、准确度和选择性，可用于对具有荧光性质的中药的定性定量分析[18]。

刘春美等[19]选取分别来自广西、贵州、西藏的每个地区各20个三七头断面。通过多元散射校正(multiple scattering correction，MSC)、Norris平滑预处理来消除干扰。此外，为了放大、分离其重叠信息，还采用对光谱一阶求导、二阶求导的方式。通过多种方法的交叉试验，结果表明利用近红外光谱以及TQ Analyst软件建模相结合的方式，可以清楚直观的检测出2种中药的相似与不同，比较适合检测组成成分复杂的中药。

Fan等[20]使用三维同步荧光光谱法(3D-synchronous fluorescence spectroscopy，3D-SFS)对6种天麻(来自3个不同地理起源的2个变体)进行分类和鉴定。从6种类型的天麻获得的水提取物的3D-SF光谱通过LS-50B发光荧光光谱仪测量。试验结果表明，6种光谱的特征荧光光谱区域相似，而特征区域的强度却有明显差异，可以成功地区分6种类型的天麻。综上所述，三维同步荧光光谱法具有有效、特异、快速、无污染等优点，在区分同类中草药方面具有优势，该方法是分类和识别不同变体和不同地理起源的天麻的有效工具。

1.4 气相色谱技术气相色谱技术的应用主要是对中药中挥发性成分或是通过衍生化后可气化的成分进行检测，通过加热等方法使待测物质中挥发性物质在短时间内蒸发，蒸发的气体进入气相色谱柱进行分离和分析[21]。直接蒸发气相色谱法能够使用少量样本，仅需1～2 mL，待测样本处理时间短，在蒸发容器内加热数分钟即可蒸发成气体，避免中药中含量低的成分所需大量样本的浪费[22]。

邢旺兴等[23]分析了来自上海的紫色红曲霉、橙色红曲霉、变红红曲霉、红色红曲霉、发白红曲霉、巴克红曲霉和烟色红曲霉7种红曲霉以及作为对照的土曲霉的挥发性成分，采用毛细管气相色谱法得到色谱图，进行数据分析。结果表明，不同种红曲霉挥发性成分的种类和含量均存在显著差异，从而认定毛细管气相色谱法对于鉴别红曲霉属真菌具有一定的实用价值，同时为红曲霉挥发性成分的分析提供可靠数据。

Wu等[24]通过气相色谱法对23种不同贝母中的7种主要活性碱生物进行检测，发现这7种类固醇生物碱可以作为一项有效的指标，根据贝母中这些生物碱的种类和含量，可以区分不同地理分布的贝母。结果表明，气相色谱可以作为一种简单而统一的方法，区别不同来源的贝母草药。

气相色谱法通常与其他方法(如质谱、光谱)联用，才能获得相对精确具有实际应用意义的结果。滕中秋等[25]应用基于顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱技术(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)的满山香挥发性成分的定性与半定量的分析方法，对云南武定、云南罗平、贵州清镇与湖北神农架4个不同产地的满山香中挥发性成分进行分析，共鉴定出了54 种成分，4个产地共有46种相同的挥发性成分，其中莰烯最高，2-蒎烯、桉叶油醇、对伞花烃、乙酸冰片酯、衣兰油烯、桧烯、石竹烯等也具有较高的含量；所鉴定成分的含量分别占各自挥发性物质总量的98.63%、98.17%、98.62%以及98.12%。试验结果表明，采用该联合技术能够很好地表征满山香的挥发性成分的组成信息，通过挥发性组分分析可以区分4个产地的满山香。从而认定，顶空固相微萃取与气相色谱质谱联用技术可以有效、快速地分析满山香的挥发性组分并对不同产地样品进行区分，是一种行之有效的鉴别技术。

1.5 液相色谱技术液相色谱技术主要操作就是以高压输液泵为主要的运行设备，将诸多成分比例不同的混合溶液或者单一溶液形成的流动相，借助设备压进固定相的专有色谱柱，注入样品中，从而借助流动相流入色谱柱，在色谱柱里，各种成分会得到充分地分离，然后逐渐进入检测设备，对样品展开全方位的化学分析，是中药产地溯源中的关键方法[26]。

Li等[27]应用高效液相色谱法，使用超高效液相色谱仪分析厚朴酚、和厚朴酚的含量，使用冷浸法测定水溶性提取物的含量，分别用电子鼻和色度计确定所收集的厚朴样品的气味和颜色特征。基于电子鼻和色度计数据建立了不同的判别模型，以区分厚朴的起源，并预测厚朴酚、和厚朴酚、厚朴素、厚朴碱和水溶性提取物的化学成分。结果表明，随机森林分类器与十倍交叉验证法相结合，对原产地的分类精度最高，占模型的99.53%。5种化学成分的预测值与试验值之间的相关系数均高于0.96。研究表明，电子鼻和色度计是定性和定量评估中药质量的有前途的方法。

Cui等[28]基于高效液相色谱(HPLC)指纹图谱分析与相似度分析、层次聚类分析(hierarchical cluster analysis，HCA)、主成分分析(principal component analysis，PCA)和单一标记定量分析(quantitative analysis multi-components by single marker，QAMS)相结合的分析方法，建立了一种全面有效的鉴定石韦叶药材质量的评价方法。收集20个通用模型的峰，用于相似性分析、HCA、PCA和QAMS分析。这些方法得出了类似的结论：HCA和PCA将42例石韦叶样品分为3类，且大部分成分相似的样品主要集中在山西、广西和四川等地区。当将QAMS方法与外标方法(external standard method，ESM)进行比较时，通过绿原酸的值来评估石韦的质量是可行的。总之，这些方法已成功地用于鉴定草药来源和评估石韦叶的质量。因此，这些评价方法有望在中药的质量控制中得到广泛应用。

Zhou等[29]建立快速有效的加压液体萃取(pressurised liquid extraction，PLE)和超高效液相色谱结合光电二极管阵列(ultra-performance liquid chromatography coupled with photodiode array，UPLC-PDA)方法来评估甘草种类的质量。在3个静态萃取循环中，甘草用PLE在70 ℃和100%的乙醇中萃取15 min，使用UPLC系统进行分离，对中国不同批次的12批样品中的5种生物活性化合物进行定量，这5种生物活性化合物分别为：脂质体皂苷、脂蛋白、脂蛋白原、甘草酸和甘草次酸。此外，使用超高效液相色谱仪结合电喷雾电离和飞行时间质谱仪(UPLC /electrospray ionisation and time-of-flight mass spectrometry，ESI-QTOF-MS)系统对样品进行分析，以确认结果。结果表明，所有5种分析物的校准曲线均显示出良好的线性(R2> 0.999 7)。准确性、精度和可重复性均在要求的范围内。在3种浓度下测得的平均回收率均高于93.7%。从而认定，建立的PLE和UPLC-PDA方法可作为快速有效的甘草质量评价方法。在中药的常规质量控制中，特别是在需要高样品通量和快速分析速度的情况下，可以认为UPLC技术是HPLC的一种值得注意的替代方法。

1.6 代谢组技术代谢组技术是通过各种检测方法对提取物中的代谢物进行全面定性和定量分析。随着核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)和气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)等技术的迅速发展，代谢组技术已广泛用于中药资源研究[30]。

Nguyen等[31]通过基于DNA技术对来自韩国和中国的60个人参样品的23个叶绿体基因间隔区域进行研究，显示出相似的遗传组成。因此，应用基于1H NMR和潜在的结构鉴别分析(orthogonal projections on the latent structure-discrimination analysis，OPLS-DA)上具有正交投影的代谢组学，并成功找出7种主要代谢物作为判别标记物，用于区分来自2个国家的样品。此外，为了在现实中重现掺假，使用新建的OPLS-DA模型测试了21个韩国/中国比率不同的混合样本。结果表明，根据混合比例，分离效果令人满意。最后，构建了具有良好预见性的混合比例程序，通过指出伪造样品的混合比例，评估故意混合样品，从而验证了其在中药质量控制的应用前景。

Kang等[32]采用了基于NMR的代谢组方法，并结合了正交投影来进行潜在的OPLS-DA多变量分析。首先通过NMR研究分析了黄芩的代谢产物，随后使用OPLS-DA进行的整体数据分析产生一个统计模型，该模型可以清晰地区分样本组。通过统计分析全相关光谱，确定了柠檬酸和精氨酸是韩国和中国样品的主要区别代谢物。为了验证判别模型，使用外部测试集对样本来源进行了盲预测测试。产生的模型正确预测了所有11个测试样品的来源，证明了其稳定性。该方法的准确鉴别力和统计有效性表明了其在确定中药来源方面具有普遍适用性。

Suzuki等[33]将基于电子电离质谱(electron ionization mass spectrometry，EI-MS)的代谢组方法应用于苦参，以鉴定每个样品的地理来源。使用EI-MS数据进行主成分分析，得出的分数图显示，日本苦参样本与中国苦参样本存在差异。因此，认定基于EI-MS数据的代谢组是确证苦参样品地理起源的有价值的工具。结果表明，基于EI-MS的代谢组适用于包含许多成分的传统药物的质量控制。

Li等[34]采用代谢组方法比较了不同生长区域的3批款冬花。结果表明，3批款冬花的一级和二级代谢产物互不相同。正丁醇提取物的聚集模型与原油提取物和血清的聚集模型相似，表明极性化合物(如苯丙烷和类黄酮)在款冬花水提取物中起重要作用。结果表明，代谢组方法可以用作鉴别不同来源的中药。

1.7 矿物元素技术常见的矿物元素技术有电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-massspectrometry，ICP-MS)技术和X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)技术等，ICP-MS技术是以等离子体为离子源，将待测物质用电感耦合等离子体离子化后，按离子的质荷比分离，测量各种离子谱峰强度的一种质谱型元素分析方法。ICP-MS提供中药中无机元素信息，在中药的组成、含量及品种差异等方面都有应用[35]。与传统无机分析技术相比，ICP-MS技术具备检出限更低、动态线性范围更宽、干扰更少、分析精密度和分析速度较高等优点[36]。

通过ICP-MS技术，刘圣金等[37]检测出了青礞石药材中的25种矿物元素，除了硅元素(均值达到260.8 mg/g)外，铁、钠、钾、铝、镁、钙等元素的含量亦较高，均值依次为75.0、 39.8、37.5、32.0、 25.3、14.4 mg/g，确定以上7种元素为青礞石主要成分，对青礞石的质量控制具有一定的现实意义。

李沁等[38]测定玄明粉中无机元素的含量，结果筛选出8种主要无机元素(均值含量>0.5 mg/kg)，得出大多数样品的相似度较好。这项研究为玄明粉提供了在安全性评价及其质量标准的制定等方面的参考依据。

与此同时，XRD技术是一种针对固体粉末样品测试的现代分析方法，将矿物药样品制成粉末进行X射线照射可得到XRD图谱。XRD图谱具有重现性好、专属性强等优点，在矿物药的鉴别和质量评价中具有独特的优势[39]。

谢仁权等[40]使用粉末XRD技术测定和分析了10个不同产地玄精石正品，对其进行元素含量的整体特征，利用XRD整体识别法，直接获取10批玄精石的X射线共有图谱，发现不同产地的玄精石X射线衍射指纹图谱相似度均超过98%，同时分析了不同产地微量元素的有无及含量，发现存在明显差异，为玄精石的质量控制、快速鉴别和安全用药提供了更为全面可靠的依据。

2 研究趋势

2000年后，稳定同位素技术、DNA技术、光谱技术、气相色谱技术、液相色谱技术、代谢组技术、矿物元素技术应用于中药产地溯源与真伪鉴别的文献数量随年份的变化如图1所示。2000—2005年，中药产地溯源与真伪鉴别的文章数量较少，可能是因为技术相对不成熟，条件相对局限所致；从2006年开始，中药产地溯源与真伪鉴别研究呈快速上升趋势，2010年后研究数量增长迅速，2012年前后有所下降，直至2015年后发表数量又迅速升高，可见随着设备和技术的提升，人们对中药产地溯源与真伪鉴别的研究愈加丰富。

图1 中药产地溯源与真伪鉴别文章数量随年份的变化Fig.1 The number of articles on the origin and authenticity of traditional Chinese medicine origin changes with years

分析技术在中药产地溯源与真伪鉴别中获得了广泛的关注，不同的分析技术有着不同的优势与特点。7种溯源技术在国内外中药产地溯源与真伪鉴别中的应用比例见图2。稳定同位素技术在中药产地溯源与真伪鉴别中应用所占比例较多，主要因为稳定同位素技术在近几年开始变得成熟稳定，准确率较高且成本较低，从而被广泛应用；因大多数中药都有DNA的存在，包含了丰富的物种特异性信息，因其独有的遗传特性，从而DNA技术在近几年逐渐普及；矿物元素技术占较高的比例是因其灵敏度高、分析速度快、特异性强等特点而应用较多；虽然光谱技术、代谢组技术、液相色谱技术和气相图谱技术应用较少，但各具优势，在今后溯源技术的联合应用中将发挥重要作用，许多研究是通过2种及以上的技术得出相对精确的试验结果。

图2 7种分析技术在中药产地溯源与真伪鉴别中的应用Fig.2 The application of seven analysis techniques in the traceability and authenticity research of the origin of traditional Chinese medicine

3 结语

随着设备的普及和技术的提升，应用于中药产地溯源和真伪鉴别的技术在不断完善，但因为我国中药种类繁多，中药产业发展方式粗放，目前还没有一种技术可以完全独立且准确地应用于中药的溯源管理和真伪鉴别。每种技术都有各自的优缺点，在实际应用的过程中可以根据每种技术的优缺点，扬长避短，多种技术联合应用，再联系我国中药的生产特点，实施最大范围的全程可追溯管理，建立一套完整的追溯体系。随着国民安全意识的增强和国家对医药安全的重视，中药产地溯源系统的发展将得到优化，真伪鉴别技术发展越来越快，不断加大仿品伪品的打击力度，溯源技术将朝着快速化、精准化、微量化、多样化和标准化的方向发展。