乙二胺四乙酸络合-氨水溶解-电感耦合等离子体质谱法测定酸性原料药中24种元素杂质的含量

朱晨华,周 舟,沈 杰,吴冬梅

(安捷伦科技(中国)有限公司上海第一分公司,上海 200080)

重金属元素对人体有严重的毒理效应,会损害人体神经组织和器官等,给人类健康带来严重威胁[1-2]。药品研发生产过程中可能引入元素杂质,从而对药物稳定性和保质期造成负面影响。2017年12月22日,国家食品药品监督管理总局药品审评中心发布的《已上市化学仿制药(注射剂)一致性评价技术要求》(征求意见稿)中明确规定了原料药的元素杂质、包材相容性和质量工艺中元素杂质的检测等,并且还指出要“根据国际人用药品注册技术协调会议(ICH)元素杂质指导原则Q3D(简称ICH Q3D)的规定,通过科学和基于风险的评估来确定制剂中元素杂质的控制策略,包括原辅包、生产设备等可能引入的元素杂质”[3]。因此,测定药物中重金属元素杂质含量对保障人体健康至关重要[4]。ICH Q3D 规定了锂、钒、铬、钴、镍、铜、砷、硒、钼、钌、铑、钯、银、镉、锡、锑、钡、锇、铱、铂、金、汞、铊、铅等24种元素杂质的每日最大允许暴露量值(PDE),推荐的检测方法为电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)。ICP-MS因具有可多元素同时测定、质谱干扰少、检出限低以及专属性强等优势,成为元素杂质分析的首选方法[5-6]。

原料药中元素杂质检测的前处理方法以酸溶、湿法消解或者微波消解为主,但这些方法需要消耗大量的酸,可能对待测元素造成干扰,而且阿司匹林、布洛芬等酸性药物难以被彻底消解。因此,寻找一种快速的前处理方式[7-9],对原料药的监控有十分重要的现实意义。本工作以氨水溶解酸性原料药,考察了乙二胺四乙酸(EDTA)对元素杂质稳定性的影响,根据ICH Q3D 和美国药典(USP)〈232〉的要求对该方法进行验证[10-13],提出了ICP-MS测定酸性原料药中24种元素杂质含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

7900型电感耦合等离子体质谱仪,配Micromist雾化器、珀尔帖冷却的石英雾化室、炬管(内径2.5 mm)、镍锥。

碲、钪、锗、铟、镥、铋的混合标准溶液:碲质量浓度为25 mg·L-1,钪质量浓度为10 mg·L-1,锗、铟、镥、铋质量浓度均为5 mg·L-1。

EDTA 溶液:0.5 g·L-1,称取0.05 g EDTA,用水溶解后定容至100 mL,配制成0.5 g·L-1EDTA溶液。

混合内标溶液:称取0.05 g EDTA,加入50 mL水溶解,再加入2 mL 异丙醇,最后用水定容至100 mL。用该溶液逐级稀释碲、钪、锗、铟、镥、铋的混合标准溶液,得到碲质量浓度为500μg·L-1,钪质量浓度为200μg·L-1,锗、铟、镥、铋质量浓度均为100μg·L-1的混合内标溶液。

氨水、EDTA 均为色谱纯;试验用水为去离子水。

1.2 仪器工作条件

射频功率1 550 W;冷却气流量12 L·min-1,辅助气流量1.0 L·min-1,载气流量0.9 L·min-1;碰撞气为氦气,流量5 L·min-1;采样深度10 mm。待测元素/内标同位素依次为6Li/45Sc、51V/45Sc、52Cr/45Sc、59Co/45Sc、60Ni/45Sc、63Cu/45Sc、75As/72Ge、78Se/72Ge、95Mo/115In、101Ru/115In、103Rh/115In、105Pd/115In、107Ag/115In、111Cd/115In、118Sn/115In、121Sb/125Te、137Ba/125Te、188Os/175Lu、193Ir/175Lu、194Pt/175Lu、197Au/175Lu、202Hg/209Bi、205Tl/209Bi、208Pb/209Bi。

1.3 试验方法

称取0.200 g样品,加入25 mL EDTA 溶液,于90 ℃加热10 min,冷 却,加 入0.3 mL 氨 水,再 用EDTA 溶液定容至50 mL,涡旋3 min,得到供试品溶液,按照仪器工作条件进行测定,通过蠕动泵在线加入混合内标溶液。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的选择

试验对比了二甲基亚砜(DMSO)、氨水及硝酸等试剂对样品的溶解性能。结果表明:硝酸难以彻底消解带有苯环的样品,并且采用5%(体积分数)硝酸溶液消解时会产生大量沉淀;DMSO、氨水对带有苯环的原料药均有良好的溶解性,但DMSO 属于有机试剂,直接进样测定会在采样锥表面形成大量的积碳,需要配置加氧设备及铂锥等附件,若使用标准加入法或基体匹配法进行定量,增加了仪器和操作时间成本;而酸性原料药在0.6%(体积分数,下同)氨水溶液中有良好的溶解性,不会对ICP-MS石英进样系统造成腐蚀,减少了测试成本,同时方便日常操作。

虽然酸性原料药可在0.6%氨水溶液中快速溶解,但多数元素杂质在碱性环境中稳定性差,甚至产生沉淀。分析结果表明,大多数元素杂质的标准曲线在0.6%氨水溶液中的相关系数小于0.990 0,测试结果不稳定,不符合USP 要求。EDTA 是一种重要的络合剂,它可以与多种元素形成稳定络合物。为解决元素杂质在碱性条件下稳定性差、测定结果精密度差的问题,试验选用EDTA 对元素杂质络合后再进行分析。结果发现:当标准溶液中元素杂质与EDTA 的物质的量比为10∶1时,在0.6%氨水溶液中出现絮状沉淀;而元素杂质与EDTA 的物质的量比为1∶10时,在0.6%氨水溶液中则可得到澄清溶液。为使元素杂质充分络合,经多次试验,最终选择0.5 g·L-1EDTA 溶液为络合剂。

由于大多数络合物在弱酸性至中性条件下更稳定,而EDTA 为弱酸性,有利于形成络合物,因此将样品先加入到EDTA 溶液中,使元素杂质络合后再用氨水溶解。但某些元素(如铬)在常温下与EDTA形成络合物的时间较长,延长了前处理的时间,因此试验选择在90 ℃条件下加热10 min,从而提高络合效率。按照此方法绘制标准曲线,24种元素杂质的相关系数均大于0.999 0,满足USP要求。

2.2 增敏剂的选择

参考《中华人民共和国药典》(2020年版),采用内标校正的标准曲线法进行定量,但试验发现采用ICP-MS分析时,供试品溶液中的有机物会对部分元素产生有机增敏效应[14-15],导致砷、汞等元素的加标回收率超过120%。为减少有机物对测定结果的影响,试验选择在混合内标溶液中加入有机物异丙醇,以减少标准溶液和供试品溶液中有机物含量的差异。结果表明,以2%(体积分数)异丙醇溶液配制混合内标溶液时,各元素的加标回收率均在70.0%～150%内。

2.3 标准曲线和检出限

ICH Q3D 与USP〈232〉规定了药物中24种元素杂质的PDE。对于需要消解或稀释的样品,必须根据样品稀释倍数和推荐的药物每日最大剂量将PDE转化为制得试样中测得的浓度限值(J值),24种元素杂质的J 值见表1。使用专用的ICH Q3D/USP多元素混合标准溶液,以2%(体积分数)硝酸为溶剂,按照USP〈232〉要求配制成各待测元素质量浓度为各 自J值的0.5,1.0,1.5 倍(0.5 J,1.0 J,1.5 J)的多元素混合标准溶液系列,按照仪器工作条件进行测定。以各待测元素质量浓度为横坐标,以待测元素与内标响应强度比值为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表1。

连续测定7份空白样品溶液,以3倍标准偏差(s)计算检出限(3s),结果见表1。

表1 24种元素杂质的J值、线性参数和检出限Tab.1 J values,linearity parameters and detection limits of 24 impurity elements

表1 (续)

2.4 系统适用性

根据USP〈232〉漂移性能测试要求,在测定样品溶液前后,分别对1.5 J混合标准溶液进行测定,计算漂移率,两次测定时间间隔约为3 h。结果显示:24种元素杂质漂移率为-6.9%～5.1%,满足漂移率的绝对值不超过20%的要求。

2.5 样品分析

按照试验方法测定阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸等3种酸性原料药中24种元素杂质的含量,结果见表2。

表2 样品分析结果Tab.2 Analytical results of the samples μg·kg-1

2.6 回收试验

根据USP〈232〉要求,对样品进行0.5 J,1.0 J,1.5 J 等3 个浓度水平的加标回收试验,结果见表3。

表3 回收试验结果Tab.3 Results of test for recovery

结果显示:24 种元素杂质的加标回收率为84.9%～111%,满足USP〈232〉和ICH Q3D 对回收率的限定要求(70.0%～150%)。

本工作用EDTA 络合元素杂质后,再用氨水对酸性原料药进行溶解,并采用ICP-MS测定酸性原料药中24种元素杂质的含量。相较于传统微波消解方式,本方法样品处理时间短,而且样品可完全溶解,降低了操作难度和仪器硬件配置的成本,提高了分析效率,可实现样品的高通量分析。