白芍总苷调控NF-κB/NLRP3 信号通路对急性痛风性关节炎大鼠的影响 机制研究①

畅秀丽 张安兵 （湖北文理学院附属医院，襄阳市中心医院风湿免疫科，襄阳 441021）

急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）是一种常见的炎症性关节炎，其主要特征为尿酸增加和关节内尿酸钠晶体（monosodium urate，MSU）积累，表现出强烈疼痛、关节肿胀及活动性炎症等症状，具有高发病率和致残率［1-2］。目前用于治疗AGA的药物会导致患者中枢神经系统、胃肠道、肝肾功能损伤，因此有必要寻找新的有效治疗药物，减少药物副作用［3］。白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）作为白芍提取物具有抗炎和免疫调节的作用，已被广泛用于治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病［4］。有研究表明TGP 可能通过抑制促炎因子水平，对MSU 诱导的AGA 大鼠具有治疗作用［5］。核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）/含NLR 家族Pyrin 域蛋白3（NLR family，Pyrin domain containing protein 3，NLRP3）信号通路与MSU 晶体诱导的炎症细胞因子释放有关［6］。研究发现，TGP 可通过抑制NLRP3 和NF-κB 表达抑制MSU 诱导的THP-1 巨噬细胞炎症［7］。目前，关于TGP 是否可通过调控NFκB/NLRP3通路影响AGA 模型大鼠炎症反应还未可知，因此本研究通过对其探究以期为TGP 在AGA 中的治疗机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 华中科技大学动物实验中心提供的60 只SPF 级SD 大鼠（245～290 g），许可证号：SCXK（鄂）2016-0009，适应性饲养于12 h/12 h 明暗交替的环境中1 周，期间自由饮水、采食，实验前禁食12 h。

1.1.2 主要试剂与仪器 TGP（南京景竹生物科技有限公司，货号：JZ20130101）；秋水仙碱（上海宝曼生物科技有限公司，货号：D0123）；尿酸钠（上海一研生物科技有限公司，货号：EY-5948）；TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA 试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司，货号：ER1393、ER0042、EH0185）；HE 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120-100）；蛋白提取试剂盒（武汉纯度生物科技有限公司，货号：CD-13559-ML）；BCA 蛋白检测试剂盒、HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗抗体（北京百奥莱博科技有限公司，货号：HR0329-ZHV、JN0200-GLH）；兔抗β-actin、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、NLRP3、Caspase-1 抗 体（Cell Signaling Technology，货 号：4970、3033、8242、2859、9242、15101、2225）。Invitrogen 凝胶成像系统购自赛默飞世尔；RT2100C 全自动酶标仪购自德国IFP公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型构建 60只SD大鼠以每组10只随机分为对照组、AGA组、秋水仙碱组（0.65 mg/kg）、TGP-L 组（10 mg/kg）、TGP-M 组（20 mg/kg）、TGP-H组（40 mg/kg）［8-9］。对照组和AGA 组于每天9：00 灌胃生理盐水，秋水仙碱组、TGP-L组、TGP-M组、TGP-H组每天分别灌胃0.65 mg/kg 秋水仙碱及10、20、 40 mg/kg TGP，进行7 d，第5 天给药1 h 后，除对照 组外其余大鼠右侧踝关节背侧注射0.2 ml MSU （100 mg/ml），诱导AGA模型，肉眼可见关节处僵硬、红肿及行动受限则表明造模成功，对照组注射等量生理盐水，造模结束后，再灌胃2 d，观察大鼠一般情况［10］。

1.2.2 大鼠步态及关节炎症指数评价 造模24 h后进行大鼠步态分级：0 级，行走正常；1 级，下肢微弯、跛行；2 级，下肢仅接触地面、中度跛行；3 级， 三足行走，跛行严重。关节炎症指数评价：0 级，关节正常；1级，骨标志明显、关节轻度红肿；2级，骨标志不明显、关节红肿明显；3 级，出现关节外红肿 现象［11］。

1.2.3 大鼠关节肿胀程度检测 于造模前及造模后6 h、12 h、24 h、48 h检测大鼠右侧踝关节容积，肿胀程度（%）=（造模前关节容积-测试时间点关节容积）×100%。

1.2.4 HE 染色观察大鼠踝关节滑膜组织病理学变化 随机选取5 只大鼠，颈椎脱臼处死后于关节腔中注射生理盐水（1 ml），活动关节后收集关节液，随后取踝关节滑膜组织于多聚甲醛（4%）中固定24 h，乙醇脱水（5 min）、石蜡包埋后进行常规切片（4 µm）、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、苏木精-伊红染色、梯度乙醇脱水，封片后显微镜观察（n=5）。

1.2.5 ELISA 法检测大鼠关节液中炎症因子水平 通过ELISA检测试剂盒检测所得关节液中肿瘤TNF-α、IL-1β、IL-6水平，按试剂盒说明书操作。

1.2.6 Western blot 检测大鼠踝关节滑膜组织各蛋白表达情况 取余下5 只大鼠踝关节滑膜组织，使用组织裂解液裂解组织后提取总蛋白，根据BCA 试剂盒说明书检测组织总蛋白含量；取上样缓冲液与蛋白混匀后100 ℃变性5 min，进行SDS-PAGE 凝胶电泳（40 µg/孔），低温转至PVDF膜，经过5%脱脂奶粉封闭1 h 后，加入兔抗β-actin、p-NF-κB p65、NFκB p65、p-IκBα、IκBα、NLRP3、Caspase-1（1∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜，PBS 清洗3 次，添加HRP 标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶3 000）孵育2 h，添加发光试剂（ECL Reagent）显色，蛋白凝胶成像仪观察后进行定量分析（n=5）。

1.3 统计学分析 SPSS20.0 统计学软件进行数据分析，以±s描述计量资料，采用单因素方差分析进行多组间比较，采用SNK-q检验多组间的两两比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 对照组大鼠关节无肿胀现象、皮毛光亮、运动灵活；AGA 组大鼠关节肿胀、跛行、皮毛无光泽、精神倦怠、活动量及进食量减少；秋水仙碱组、TGP-L 组、TGP-M 组、TGP-H 组大鼠关节肿胀、皮毛光泽度、饮食、精神状态及行动均得到有效改善。

2.2 TGP 对AGA 大鼠步态与关节炎症指数的影响 与对照组相比，AGA 组大鼠步态级别与关节炎症指数显著升高（P＜0.05）；与AGA 组相比，秋水仙碱组、TGP-L组、TGP-M组和TGP-H组大鼠步态级别与关节炎症指数显著降低，存在TGP剂量依赖性（P＜0.05）；与秋水仙碱组相比，TGP-H 组大鼠步态级别与关节炎症指数差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 TGP 对AGA 大鼠步态与关节炎症指数的影响（±s， n=10）Tab.1 Effects of TGP on gait and arthritis index of AGA rats （±s，n=10）

表1 TGP 对AGA 大鼠步态与关节炎症指数的影响（±s， n=10）Tab.1 Effects of TGP on gait and arthritis index of AGA rats （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with AGA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-L group， 3）P＜0.05； compared with TGP-M group， 4）P＜0.05.

2.3 TGP 对AGA 大鼠关节肿胀的影响 AGA 组、秋水仙碱组、TGP-L组、TGP-M组和TGP-H组大鼠关节肿胀程度在6 h 时最大，随着时间的增加，肿胀程度逐渐减轻；与对照组相比，AGA 组大鼠各时间点关节肿胀程度显著提高（P＜0.05）；与AGA 组相比，秋水仙碱组、TGP-L组、TGP-M组和TGP-H组各时间点大鼠关节肿胀程度显著降低，存在TGP 剂量依赖性（P＜0.05）；与秋水仙碱组相比，TGP-H 组各时间点大鼠关节肿胀程度差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 TGP对AGA大鼠关节肿胀的影响Fig.1 Effect of TGP on joint swelling in AGA rats

2.4 大鼠踝关节滑膜组织病理学观察 对照组大鼠关节滑膜结构正常，无炎症细胞浸润现象发生；AGA 组滑膜水肿、充血、增生现象明显，炎症细胞浸润严重；秋水仙碱组、TGP-L 组、TGP-M 组和TGP-H组滑膜水肿、增生现象减轻，炎症细胞浸润程度得到改善，见图2。

图2 大鼠踝关节滑膜组织病理学观察（HE，×200）Fig.2 Histopathological observation of synovium of ankle joint in rats （HE， ×200）

2.5 TGP 对AGA 大鼠膝关节腔冲洗液炎症因子 水平的影响 与对照组相比，AGA 组大鼠关节腔冲洗 液中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水 平显 著 升 高（P＜0.05）；与AGA组相比，秋水仙碱组、TGP-L组、TGP-M组和TGP-H 组TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平显著降低，存在TGP 剂量依赖性（P＜0.05）；与秋水仙碱组相比，TGP-H 组TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 TGP 对AGA 大鼠膝关节腔冲洗液炎症因子水平的 影响（±s，n=5，ng/L）Tab.2 Effect of TGP on inflammatory factors in knee joint irrigation fluid of AGA rats （±s，n=5，ng/L）

表2 TGP 对AGA 大鼠膝关节腔冲洗液炎症因子水平的 影响（±s，n=5，ng/L）Tab.2 Effect of TGP on inflammatory factors in knee joint irrigation fluid of AGA rats （±s，n=5，ng/L）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with AGA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-L group， 3）P＜0.05； compared with TGP-M group， 4）P＜0.05.

2.6 TGP 对AGA 大鼠关节滑膜组织NF-κB/NLRP3通路相关蛋白表达的影响 与对照组相比，AGA 组大鼠关节滑膜组织p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表达显著增加，而p-IκBα/IκBα 表达显著降低（P＜0.05）；与AGA 组相比，秋水仙碱组、TGP-L组、TGP-M 组和TGP-H 组p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表达显著降低，p-IκBα/IκBα 表达显著增加，存在TGP剂量依赖性（P＜0.05）；与秋水仙碱组相比，TGP-H组p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα、NLRP3、Caspase-1 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表3、图3。

表3 TGP 对AGA 大鼠关节滑膜组织NF-κB/NLRP3 通路相关蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.3 Effect of TGP on expression of NF-κB/NLRP3 pathway related proteins in synovial tissue of AGA rats （±s，n=5）

表3 TGP 对AGA 大鼠关节滑膜组织NF-κB/NLRP3 通路相关蛋白表达的影响（±s，n=5）Tab.3 Effect of TGP on expression of NF-κB/NLRP3 pathway related proteins in synovial tissue of AGA rats （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with AGA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-L group， 3）P＜0.05； compared with TGP-M group， 4）P＜0.05.

Caspase-1/β-actin 0.53±0.10 1.51±0.281）0.56±0.112）1.26±0.212）0.89±0.152）3）0.57±0.092）3）4）Groups Control AGA Colchicine TGP-L TGP-M TGP-H p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.49±0.10 1.58±0.341）0.58±0.112）1.30±0.212）0.96±0.182）3）0.60±0.132）3）4）p-IκBα/IκBα 1.66±0.36 0.63±0.121）1.41±0.232）0.81±0.122）1.15±0.182）3）1.40±0.242）3）4）NLRP3/β-actin 0.70±0.12 1.45±0.241）0.78±0.142）1.24±0.212）1.01±0.192）3）0.80±0.162）3）4）

图3 TGP 对AGA 大鼠关节滑膜组织NF-κB/NLRP3 通路相关蛋白表达的影响Fig.3 Effect of TGP on expressions of NF-κB/NLRP3 pathway related proteins in synovial tissue of AGA rats way

3 讨论

AGA 是一种在男性中较为常见的炎症性关节炎，由高尿酸血症及MSU 晶体在关节和关节周围组织沉积所引起，且高尿酸血症作为AGA 发生的最主要因素，与心血管疾病、慢性肾脏病等多种合并症相关［6-12］。降低炎症反应是AGA 临床治疗的主要目的，目前用于治疗AGA 的常用药物秋水仙碱和非甾体抗炎药疗效有限，且长期使用可导致胃肠道出血、肾毒性等副作用［6-12］。由于天然中草药植物来源广泛、疗效好、副作用少，越来越多的研究人员将注意力逐渐集中到对其活性成分的研究中，以期寻找到有效替代药物，提高疗效，减少副作用发生［6］。

TGP作为白芍活性成分，具有镇痛、抗炎和免疫调节的作用，已被用于多种免疫性疾病的治疗［13］。TGP 通过抑制Ⅱ型胶原所诱导的关节炎模型小鼠STAT3信号通路抑制骨质破坏［13］。TGP在类风湿关节炎大鼠中可能通过下调Toll 样受体-2（Toll-like receptor-2，TLR-2）/TNF受体关联因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）/NF-κB 通路及调节T 细胞亚群发挥抗炎作用［14］。定痛汤合白芍总苷胶囊在痛风性关节炎中临床疗效甚佳，可缩短病程，改善疾病症状［15］。还有研究发现，TGP 可降低AGA 大鼠血清中TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平，抑制炎症反应［5］。本研究发现，TGP 不仅可改善关节肿胀、跛行、皮毛无光泽、精神倦怠等症状，还可显著降低AGA 大鼠步态级别、关节炎症指数、关节肿胀程度、组织病理学程度，该结果表明，TGP 对AGA 大鼠不良症状及关节病理学程度具有改善作用。本研究还发现TGP 可显著降低TNF-α、IL-6、IL-1β 表达水平，与既往研究结果相一致，该结果表明，TGP 可有效抑制AGA大鼠关节炎症反应。

NF-κB 是炎症和能量衰竭的中介，控制促炎因子的产生［1］。IκBα 是NF-κB 抑制剂，在正常状态下，NF-κB 与IκBα 在胞质中相互结合，当炎症发生时，IκBα 快速降解并与NF-κB 分离，NF-κB 转位至胞核内调节促炎因子的转录，从而促进NLRP3 信号通路的激活［1］。NLRP3 是MSU 晶体所诱导的炎症反应的关键因素，因此，阻断其激活或影响其活性可抑制AGA的发生［6-16］。当MSU晶体在关节腔内沉积后，会引发强烈的炎症反应，激活NLRP3 炎症小体和Caspase-1，刺激IL-1β 等炎症体依赖性细胞因子的释放，从而进一步激活免疫细胞释放TNF-α、IL-6 等其他促炎症细胞因子，加重炎症反应［17-18］。NF-κB 信号通路及NLRP3 炎症体轴在AGA 中被激活［19］。研究发现，TGP可通过抑制人肺腺癌转移相关转录本1（metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1），MALAT1/微小RNA 876-5p（microRNA 876-5p，miR-876-5p/NLRP3 抑制MSU 诱导的THP-1巨噬细胞炎症［7］。本研究发现TGP 可显著降低 p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3 和Caspase-1 水平，显著提高p-IκBα/IκBα 水平。该结果表明，TGP 可能通过抑制NF-κB/NLRP3 信号通路激活从而降低炎症因子的表达，以此抑制AGA大鼠炎症反应。

综上所述，TGP 可能通过抑制NF-κB/NLRP3 信号通路达到改善AGA 大鼠炎症状态的效果。本研究为TGP 在AGA 疾病治疗机制中的研究提供参考，但关于TGP 在AGA 中是否还通过调控其他通路发挥治疗作用还需进一步探究。