饲粮添加复合益生菌对产蛋后期蛋鸡生产性能、肠道抗氧化能力和肠道氨氮含量的影响

陈 欣，慈文佳，李浙烽，蔡平梨，朱建津，*

(1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122； 2.杭州康德权饲料有限公司，浙江 杭州 311107 ； 3.徐州市铜山区家禽技术指导站，江苏 徐州 221100)

在经历高强度的产蛋期后，蛋鸡肠道功能下降，各种代谢疾病的发生率升高，最终导致生产性能和产蛋率的降低[1]。抗生素曾被广泛用于预防、控制蛋鸡养殖过程中不断发生的疾病。然而，近年来关于鸡蛋中检测出违禁抗生素的现象频繁出现，抗生素残留、耐药性等问题日益突出[2]。因此，高效、价格低廉、无毒副残留的饲料添加剂成为研究关注的重点。益生菌在提高饲料转化率，调节免疫系统，预防腹泻等方面的优势使其有潜力作为高效、安全、无残留的抗生素替代品[3]。Oh等[4]发现，日粮中添加枯草芽孢杆菌CLS2 (107CFU·kg-1)改变了被沙门氏菌感染的肉鸡粪便中微生物多样性，增加了粪便中有益菌相对丰度，减少了致病菌相对丰度。有研究发现，肉鸡摄入罗伊氏乳杆菌(108CFU·d-1)可以激活Wnt/β-catenin和抑制Notch信号通路[5]，促进肠道上皮细胞增殖以及诱导肠道干细胞分化为杯状细胞，增加黏蛋白2 (MUC2)分泌，改善肠道屏障功能。此外，日粮中添加嗜酸乳杆菌(2.0×107CFU·kg-1)可以提高肉鸡的饲料转化率[6]。在产蛋后期蛋鸡的日粮中添加丁酸梭菌(8.0×108CFU·kg-1)，可以显著提高肠道内容物中脂肪酶活性[7]。

氨是机体的代谢废物，主要产自肠道。氨可以通过微生物产生的脲酶分解尿素或者尿酸生成，也可以通过微生物脱氨酶对蛋白质的消化及脱氨作用产生[8-9]。氨的产生会诱导肠道上皮细胞受损，同时具有潜在的致癌性[10]。鸡舍中氨浓度过高会导致鸡食欲减退，生产性能降低，被疾病感染风险升高等各种不良影响[11]。此外，氨气是蛋鸡养殖过程中主要的致臭气体，对生态环境造成严重的影响。通过补充益生菌减少氨的生成具有良好的发展潜力。有研究表明，摄入植物乳杆菌可以有效提高硫代乙酰胺诱导的急性肝衰竭小鼠的存活率，显著降低血氨和粪氨水平[12]。日粮补充干酪乳杆菌可以显著降低肉鸡小肠内容物中脲酶的活性，减少氨的生成[13]。补充乳酸杆菌可以提高肠道短链脂肪酸含量，降低肠道pH，减少肠道对氨的吸收[14]。

虽然益生菌在养殖生产中的有益作用已得到大量研究证实，但是，单一菌株的作用有限，在实际应用中效果也不稳定。一些研究表明，益生菌混合制剂可能整合了不同菌株的特性，结合不同的益生菌菌株比使用单一菌株更有效[15-16]。芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，可以产生抗逆性的芽孢，抵抗消化道中酸性环境，保持良好的生物活性[17]。乳酸菌是一种可以在肉鸡肠道中定植，通过产生有机酸、多糖等活性成分调控机体氧化还原稳态，缓解肠道炎症[18]。结合使用嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌可能兼顾二者的特性达到更好的应用效果。因此，本试验以50周龄海兰褐蛋鸡为研究对象，在前期预试验的基础上选取两种不同益生菌添加水平，研究其对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质、肠道抗氧化能力的影响，并对氨氮含量与盲肠微生物丰度进行了相关性分析，为其充分开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用到的复合益生菌由康丸德川科技有限公司提供，成分包括：嗜酸乳杆菌CGMCC1.1878(活菌数>1×106CFU·g-1)和枯草芽孢杆菌ACCC11088(活菌数>1×106CFU·g-1)。所用到的海兰褐蛋鸡由南京康德权蛋鸡养殖基地提供。

1.2 试验设计

2 160只50周龄的海兰褐蛋，体重(2.0±0.1)kg，产蛋率(86.7±0.3)%，鸡随机分为3组，每组10个重复，每个重复72只。对照组(NC组)饲喂基础日粮，基础日粮配制参考NRC(1994)，配方及营养水平见表1。试验组在基础日粮中分别添加益生菌复合制剂250 mg·kg-1(LD组)、500 mg·kg-1(HD组)。试验期49 d。鸡舍环境温度23 ℃，每天光照时长16 h。所有试验动物均可自由采食和饮水。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 生产性能及蛋品质

每天记录各组蛋鸡产蛋数，总蛋质量，每周统计饲料消耗量。49 d时，每个重复随机挑选1枚鸡蛋，用于检测鸡蛋的品质，蛋品质检测方法参考Feng等[19]的研究。

1.3.2 样品收集

每个重复随机挑选1只蛋鸡，进行屠宰。翼静脉取血并收集于含有肝素钠的抗凝管中，4 000 r·min-1离心15 min，吸取上清液血浆-80 ℃保存。解剖肠道后收集盲肠内容物，液氮速冻后转入-80 ℃保存。收集回肠和盲肠组织用于检测肠道抗氧化指标。取1 cm盲肠组织，PBS洗去内容物，0.4%多聚甲醛固定24 h用于组织切片观察。

1.3.3 肠道抗氧化指标测定和组织形态学观察

总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性检测试剂盒，购于南京建成生物工程研究所，并严格按照试剂盒说明书进行测定。盲肠组织H&E切片制作和染色方法参考刘江英等[20]的方法。

1.3.4 血浆和盲肠内容物生化指标

血浆和盲肠内容物中氨氮，尿素氮，尿酸含量用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。盲肠内容物中，谷氨酸脱氢酶(GDH)，谷氨酰胺合成酶(GS)活性用南京建成试剂盒测定，脲酶和尿酸酶活性检测方法参考之前报道的方法[21]。

1.3.5 气相色谱测定盲肠内容物中短链脂肪酸

短链脂肪酸的测定方法参考之前的研究[22]。

1.3.6 盲肠内容物中微生物检测

盲肠内容物中DNA提取，PCR扩增，Illumina MiSeq测序以及数据的处理参考Liu等[23]的报道。

表1 基础日粮营养组成与含量

1.4 数据统计和分析

使用IBM SPSS Statistics 20.0进行数据分析，如果数据符合正态分布则使用单因素方差分析(ANOVA)以及Duncan检验进行组间比较，如果数据不符合正态分布，则使用Kruskal-Wallis分析，微生物丰度与氨氮相关性使用皮尔逊相关性分析。结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 复合益生菌对产蛋后期蛋鸡生产性能和蛋品质的影响

由图1可知，在第4～7周HD组产蛋率显著高于NC组(P<0.05)，在第3、4、6、7周LD组产蛋率显著高于NC组(P<0.05)。整个试验周期中，与NC组相比，HD组蛋鸡每日饲料摄入量显著降低(P<0.05)，LD组每日饲料摄入量有所下降但差异不显著(P>0.05)。料蛋比随着嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合制剂含量升高有下降趋势，但组间差异不显著(P>0.05)。由表2 可知，与NC组相比，HD组蛋白高度和哈夫单位有上升的趋势，但差异不显著(P>0.05)。这表明，饲粮添加嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合制剂可以提高产蛋后期蛋鸡的产蛋率，但是对鸡蛋品质无显著影响(P>0.05)。

*代表NC组与LD组间有显著差异(P<0.05)，#代表HD组与NC组间有显著差异(P<0.05)；柱上无相同字母的表示组间差异显著(P<0.05)。下同。* represented a significant difference between NC group and LD group (P<0.05)， and # represented a significant difference between HD group and NC group (P<0.05)； No same letters on the bars indicated significant difference among groups (P<0.05). The same as below.图1 饲粮添加复合益生菌对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响Fig.1 Effects of dietary supplementation with compound probiotics on laying performance of late-phase laying hens

2.2 复合益生菌对产蛋后期蛋鸡肠道抗氧化能力和盲肠组织形态的影响

如图2所示，与NC组相比，LD组回肠组织CAT、GSH-Px活性显著升高(P<0.05)，HD组回肠组织T-AOC，CAT、GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。在盲肠中，与NC组相比，LD组中T-AOC活性显著升高(P<0.05)，同时，HD组中T-AOC，CAT、SOD、GSH-Px活性均显著上升(P<0.05)。HD组回肠T-AOC，GSH-Px活性显著高于LD组。如图3所示，NC组蛋鸡盲肠刷状缘出现畸形，同时发现隐窝消失的现象，LD和HD组蛋鸡盲肠结构正常，未发现明显的异常变化。这说明日粮补充嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合制剂可以提高蛋鸡盲肠和回肠抗氧化能力，增加盲肠的完整性。

表2 饲粮添加复合益生菌对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

图2 饲粮添加复合益生菌对产蛋后期蛋鸡盲肠和回肠组织抗氧化能力的影响Fig.2 Effects of dietary supplementation with compound probiotics on the antioxidant capacity of cecum and ileum tissues in late-phase laying hens

图3 饲粮添加复合益生菌对产蛋后期蛋鸡盲肠组织形态结果的影响(H&E染色，×200)Fig.3 Effects of dietary supplementation with compound probiotics on the histopathology of cecum in late-phase laying hens (H&E staining， ×200)

2.3 复合益生菌对产蛋后期蛋鸡氨代谢和相关酶活性的影响

如图4所示，HD组蛋鸡盲肠内容物中的氨氮，尿素氮含量显著(P<0.05)低于NC组和LD组，尿酸含量显著(P<0.05)高于NC组，LD组蛋鸡盲肠内容物中氨氮、尿素氮、尿酸水平与NC组相比无显著差异(P>0.05)。血浆血氨、尿素、尿酸含量在3个组间没有显著的差异(P>0.05)。

图4 饲粮添加复合益生菌对产蛋后期蛋鸡盲肠内容物和血浆中氨代谢物含量的影响Fig.4 Effects of dietary supplementation with compound probiotics on the ammonia-related metabolites in the contents of the cecum and plasma in late-phase laying hens

如表3所示，与NC组相比，HD组中盲肠内容物中尿酸酶相对活性显著下降(P<0.05)，LD组尿酸酶活性有下降的趋势，但与NC组的差异不显著(P>0.05)。盲肠内容物中脲酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶在3个组间无显著差异(P>0.05)。

表3 饲粮补充复合益生菌对产蛋后期蛋鸡盲肠内容物中氨代谢相关酶活性的影响

2.4 复合益生菌对盲肠内容物中短链脂肪酸的影响

如图5所示，饲粮添加嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合制剂可以显著增加盲肠内容物中总短链脂肪酸的含量。其中，LD组蛋鸡盲肠内容物中乙酸、正戊酸、异戊酸显著高于NC组(P<0.05)，在HD组中，乙酸、丙酸、正丁酸含量显著高于NC组(P<0.05)。LD组和HD组相比，几种短链脂肪酸含量之间没有显著差异(P>0.05)。

图5 饲粮补充嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合制剂对产蛋后期蛋鸡盲肠内容物中短链脂肪酸含量的影响Fig.5 Effects of dietary supplementation with compound probiotics on the short-chain fatty acids in contents of cecum in late-phase laying hens

2.5 盲肠内容物中微生物相对丰度与氨水平间的相关性分析

如图6所示，盲肠内容物中的拟杆菌相对丰度与氨氮、尿素含量显著正相关，梭状芽孢杆菌属相对丰度与尿酸水平显著正相关。别样杆菌和考拉杆菌属相对丰度与尿酸显著负相关；瘤胃球菌、别样杆菌与氨氮含量显著负相关；梭状芽孢杆菌属与尿素含量显著负相关。

图6 产蛋后期蛋鸡盲肠内容物中氨氮、尿素、尿酸与盲肠微生物相对丰度相关性分析Fig.6 Correlation between ammonia nitrogen， urea and uric acid in cecum contents and relative abundance of cecum microbial in late-phase laying hens

3 讨论

肠道是鸡体内重要的消化器官，99%的营养物质要靠肠道吸收，同时也是重要的免疫器官，70%以上的免疫细胞位于肠道黏膜中[24]。然而，集约化养殖的背景下，处在产蛋后期的蛋鸡肠道屏障功能受损，消化吸收能力下降，并伴随着肠道炎症的发生，最终导致生产性能急剧下降[19]。本试验结果表明，饲粮添加嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合制剂可以提高肠道抗氧化能力和抗氧化酶水平，增加盲肠完整性，从而提高产蛋后期蛋鸡的生产性能。然而，在本试验中，益生菌补充对鸡蛋品质的影响较小。Guo等[25]发现，饲粮补充枯草芽孢杆菌前4周对蛋品质无显著影响，第8周时，蛋壳强度显著高于对照组，第20周试验组与对照组蛋白高度出现显著差异，这说明益生菌对鸡蛋品质的影响可能与益生菌干预时间有关。

肠道中的细菌30%为脲酶阳性菌，能够通过产生脲酶，分解尿素产氨，为自身提供氮源[37]。为了探究日粮补充复合益生菌是否可以通过改变肠道菌群从而影响氨氮代谢。我们基于16S rRNA测序结果，将肠道中尿素、尿酸以及氨含量与肠道微生物相对丰度进行斯皮尔曼相关性分析。结果表明，拟杆菌、梭状杆菌、瘤胃球菌、别样杆菌、考拉杆菌与氨氮代谢显著相关，说明这几种菌可能在调控肠道内容物氨氮含量的过程中发挥了作用。拟杆菌属和瘤胃球菌属主要通过发酵碳水化合物为自身提供能量，产生的氨气较少，梭菌属的微生物具有较强的产氨能力[21]。然而，肠道菌群影响肠道氨氮代谢的报道相对较少，具体的作用机制还需要进一步研究。

4 结论

饲粮添加嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合制剂可以改善产蛋后期蛋鸡的生产性能，增加肠道组织抗氧化能力，提高盲肠内容物中的短链脂肪酸含量和抑制肠道中氨氮的生成，并且添加量为500 mg·kg-1时的效果比250 mg·kg-1时效果更好。